محتمل ترین عدد (MPN) در کنترل کیفیت آب

تست محتمل ترین عدد^[1] (MPN) یک روش آماری بر اساس پراکندگی تصادفی میکروارگانیسم‌های موجود در حجم یک نمونه معین است. در این روش، حجم‌های اندازه ‌گیری شده از یک  نمونه به مجموعه‌ای از لوله‌های حاوی یک محیط  کشت مایع اضافه می‌شود.

از روی تعداد واکنش‌های مثبت و منفی، می‌توان محتمل ترین عدد موجودات شاخص در نمونه را با مراجعه به جداول آماری تخمین زد.

به طور کلی تست MPN در سه مرحله تکمیل می‌شود:

• آزمون فرضی (Presumptive test)
• تست تایید شده (Confirmed test)
• تست کامل شده (Completed test)

در ادامه قصد داریم به بررسی تست محتمل‌ ترین عدد، به ویژه حین کنترل کیفی آب آشامیدنی بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

هدف از انجام تست محتمل ترین عدد MPN

تست محتمل ترین عدد یا MPN معمولاً در تخمین جمعیت میکروبی در خاک، آب و محصولات کشاورزی استفاده می‌شود. این تکنیک به ویژه در مورد نمونه‌هایی که حاوی ذرات ریز هستند مفید است. زیرا در چنین شرایطی معمولا روش‌های شمارش پلیت پاسخ خوبی نمی‌دهند.

همچنین برای شمارش باکتری‌هایی که به سختی روی پلیت آگار یا فیلترهای غشایی کلنی تشکیل می دهند اما به راحتی در محیط‌های مایع رشد می‌کنند مفید است.

همانطور که در بخش مقدمه نیز گفته شد، تست محتمل ترین عدد در سه مرحله تکمیل می‌شود. در ادامه به بررسی هریک از این مراحل خواهیم پرداخت.

1- آزمون فرضی MPN

این آزمایش، یک روش غنی‌سازی خاص برای باکتری‌های کلیفرم است. در این روش از لوله‌های تخمیر حاوی یک محیط کشت انتخابی (آبگوشت لاکتوز MacConkey) استفاده می‌شود. این لوله‌‌ها حاوی لوله‌های دورهام معکوس برای تشخیص گازحاصل از تخمیر هستند. مجموعه‌ای از لوله‌ها با مقادیر اندازه‌گیری شده نمونه آب تلقیح می‌شوند. تعداد و سری لوله‌ها بسته به آزمایش و نمونه ممکن است متفاوت باشد.

فاکتورانتخابی اصلی موجود در محیط، لاکتوز است. گاهی اوقات یک سورفکتانت مانند Na-lauryl sulfate یا Na-taurocholate (نمک صفراوی)، و اغلب یک رنگ نشانگر pH برای تسهیل تشخیص تولید اسید، مانند برموکرزول بنفش یا سبز درخشان اضافه می‌شود. محیط کشت لاکتوز به این دلیل انتخاب می شود که بسیاری از باکتری‌ها نمی‌توانند این قند را تخمیر کنند. در حالی که باکتری‌های کلی‌فرم و چندین نوع باکتری دیگر قادر به تخمیر لاکتوز هستند. علاوه‌براین، سورفکتانت و رنگ، باکتری‌های کلی‌فرم را مهار نمی‌کنند. در حالی که بسیاری از باکتری‌های دیگر، مانند آن‌هایی که قادر به تشکیل هاگ هستند توسط این مواد مهار می‌شوند.

2- تست تایید شده در روش محتمل ترین عدد

این آزمایش برای تأیید وجود باکتری کلیفرم انجام می‌شود. به ویژه زمانی که یک آزمایش احتمالی مثبت یا مشکوک به دست می‌آید.

در این روش، یک لوپ از لوله حاوی نمونه مشکوک به لوله‌ای از آبگوشت لاکتوز سبز درخشان (BGLB) 2 درصد (یا آبگوشت لاکتوز) منتقل و در دمای 35 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت انکوبه می‌شود. این یک محیط انتخابی برای تشخیص باکتری‌های کلیفرم در آب، لبنیات و سایر محصولات غذایی است. عامل انتخابی در محیط، لاکتوز است. لوله حاوی آبگوشت همچنین حاوی یک لوله دورهام برای تشخیص تولید گاز است.

سپس یک لوپ حاوی نمونه کشت داده شده به روش بالا در پلیت حاوی آگار LES Endo  (یا EMB Agar) کشت داده می‌شود ( به روش استریک پلیت)  و در دمای 35 درجه سانتی‌گراد به مدت 18 تا 24 ساعت انکوبه می‌شود. باکتری‌های کلیفرم معمولی (E. coli و Enterobacter aerogenes) رشد خوبی روی این محیط نشان می‌دهند و کلنی‌های قرمز تا سیاه را با مراکز تیره یا براق تشکیل می‌دهند. سالمونلا تیفی نیز رشد خوبی از خود نشان می‌دهد، اما کلنی‌ها بی‌رنگ هستند. در حالیکه رشد استافیلوکوکوس اورئوس به طور کلی مهار می‌شود.

3- تست کامل در تست MPN

یکی دیگر از مراحل تست محتمل ترین عدد، تست کامل است. این تست به تایید بیشتر نتایج مشکوک و در صورت تمایل، تایید مثبت کمک می‌کند.

در این روش ،یک کلنی کلیفرم معمولی از یک پلیت آگار LES Endo در لوله‌ای از آبگوشت حاوی صفرا سبز درخشان و روی سطح شیب دار یک آگار مغذی تلقیح می‌شود. سپس در دمای 35 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت انکوبه می‌شود. پس از 24 ساعت، آبگوشت از نظر تولید گاز بررسی می‌شود و یک رنگ آمیزی گرم از موجودات روی آگار شیب دار مغذی تهیه می‌شود. اگر ارگانیسم یک باکتری میله‌ای گرم منفی و فاقد اسپور باشد و در لوله لاکتوز گاز تولید کند، وجود کلیفرم در نمونه آب مثبت است.

مراحل تست MPN

در بخش‌های قبلی به بررسی علل انجام هریک از آزمون‌های تست محتمل ترین عدد پرداختیم. در ادامه روش انجام هریک از این مراحل و نتایج حاصل از هر مرحله را مرور خواهیم کرد.

1- آزمون فرضی

برای انجام آزمون فرضی در تست محتمل ترین عدد، محیط MacConkey را در لوله‌های آزمایش حاوی لوله دورهام تهیه کرده و اتوکلاو کنید.

سه مجموعه از لوله‌های آزمایش بردارید. هر مجموعه باید حاوی پنج لوله باشد.

در مجموعه لوله‌های اول 10 میلی‌لیتر محیط کشت با غلظت دو برابر (double strength) ریخته شود.

در مجموعه دوم و سوم 10 میلی‌لیتر محیط کشت با غلظت یک برابر (single strength) ریخته شود.

با استفاده از پیپت‌های استریل، 10 میلی لیتر آب نمونه را به لوله‌های مجموعه اول ( حاوی ابگوشت با غلظت دو برابر) اضافه کنید.

1 میلی لیتر از آب نمونه را به لوله‌های مجموعه دوم اضافه کنید.

0.1 میلی لیتر از آب نمونه لوله‌های مجموعه سوم اضافه کنید.

لوله‌ها را به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید.

پس از انکوباسیون، تولید گاز در لوله دورهام و تغییر رنگ محیط را مشاهده کنید.

تعداد نتایج مثبت از هر مجموعه را ثبت کنید و با نمودار استاندارد مقایسه کنید تا تعداد کلیفرم احتمالی در هر 100 میلی لیتر نمونه آب بدست آید.

2- تست تایید شده

برخی از میکروارگانیسم‌ها، غیر از کلیفرم‌ها، نیز از تخمیر لاکتوز اسید و گاز تولید می‌کنند. به همین دلیل برای تایید وجود کلیفرم در تست محتمل ترین عدد، آزمایش تاییدی انجام می‌شود. برای این کار، یک لوپ حاوی سوسپانسیون از یک لوله مثبت در آزمون فرضی را، به یک آبگوشت لاکتوز 3 میلی‌لیتری یا لوله تخمیر لاکتوز سبز درخشان و به یک پلیت آگار (EMB آگار یا اندو آگار) یا مایل تلقیح کنید.

الف. تلقیح آبگوشت لاکتوز

لوله‌های تخمیر آبگوشت لاکتوز تلقیح شده را در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه کرده و پس از 2 ± 24 ساعت تشکیل گاز را بررسی کنید. اگر تولید گاز مشاهده نشد، حداکثر تا 3±48 ساعت انکوبه کنید تا تولید گاز بررسی شود.

ب- تلقیح در آگار اسلنت (مایل)

یک لوپ از سوسپانسیون را از یک لوله مثبت بردارید و آن را روی سطح آگار تلقیح کنید. آگار اسلنت (شیب دار) باید در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 2 ± 24 ساعت انکوبه شوند. در این روش کلنی‌ها باید به صورت ماکروسکوپی بررسی شوند.

3- تست تکمیل شده

یک کلنی معمولی کلیفرم را از پلیت آگار به لوله‌ای از آبگوشت صفراوی سبز درخشان با لوله دورهام و اضافه کنید. در دمای 35 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت انکوبه کنید.

بعد از 24 ساعت، آبگوشت را از نظر تولید گاز بررسی کنید و رنگ آمیزی گرم برای میکروارگانیسم ها را انجام دهید.

نتایج تست MPN

الف- آزمون فرضی

مثبت: تشکیل گاز 10 درصد یا بیشتر در لوله دورهام در عرض 24 تا 48 ساعت همراه با ایجاد کدورت در محیط کشت و تغییر رنگ محیط.

در صورت مثبت بودن، فرض می‌شود که نمونه آب به کلیفرم و در نتیجه مدفوع آلوده است. این آزمایش تنها به این دلیل محتمل است که در این شرایط چندین نوع باکتری دیگر می‌توانند نتایج مشابهی ایجاد کنند.

منفی: عدم رشد یا عدم  تشکیل گاز در لوله دورهام.

ب- تست تایید شده

مثبت: تشکیل گاز در آبگوشت لاکتوز و نشان دادن کلنی کلیفرم مانند بر روی آگار EMB نشان دهنده وجود عضوی از گروه کلیفرم در نمونه مورد بررسی است.

کلیفرم‌ها، کلنی‌هایی با درخشش فلزی مایل به سبز ایجاد می‌کنند که آ‌نها را از کلنی‌های غیرکلیفرم متمایز می‌کند (درخشندگی ندارند). وجود کلنی‌های معمولی در دماهای بالا (2/0 ± 5/44) نشان دهنده وجود باکتری E.coli مقاوم به گرما است.

منفی: عدم تشکیل گاز در آبگوشت لاکتوز یا عدم نشان دادن کلنی‌های کلی فرم مانند در EMB آگار.

ج‌-  تست تکمیل شده

مثبت: وجود گاز در لوله آبگوشت صفراوی سبز درخشان و باکتری‌های گرم منفی و بدون اسپور روی شیب آگار مغذی، یک آزمایش کامل شده مثبت برای حضور باکتری‌های کلیفرم است. که به نوبه خود آلودگی احتمالی آب را را تایید می‌کند.

منفی: عدم رشد و تشکیل گاز در آبگوشت. عدم وجود باکتری‌های گرم منفی و بدون اسپور در رنگ آمیزی گرم.

مزایا و محدودیت‌های تست محتمل ترین عدد

همانطور که در بخش‌های قبلی گفته شد، تست محتمل ترین عدد یک روش رایج برای تخمین وجود کلیفرم‌ها در نمونه‌ است. اما این روش مزایا و معایبی دارد که در ادامه بررسی خواهیم کرد.

از مزایای این روش می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

• سهولت در تفسیر، چه از طریق مشاهده یا انتشار گاز
• رقیق شدن سموم موجود در نمونه
• روش موثر آنالیز نمونه‌های بسیار کدر مانند رسوبات، لجن، گل و غیره.
• امکان آنالیز نمونه‌هایی که نمی‌توان با فیلتراسیون غشایی آنالیز کرد

محدودیت‌های تست MPN نیز به شرح زیر است:

• دقت و صحت ضعیف مرتبط با شمارش MPN معمولاً به این معنی است که این روش یکی از آخرین راه‌حل‌ها است. یعنی فقط زمانی که سایر روش‌های شمارش نامناسب هستند در نظر گرفته می‌شود.
• از نظر مواد، ظروف شیشه‌ای و فضای انکوباتور پر زحمت و گران است.
• دارای حاشیه خطای نسبتاً زیادی است.

سخن پایانی

تست محتمل ترین عدد (MPN) روشی متداول به منظور اندازه‌گیری آلودگی میکروبی است که در واقع با استفاده از روش‌های احتمالی میزان کل کلیفرم موجود در نمونه را پیش بینی می‌کند. روش  MPN برپايه نظريه احتمالات بوده و فرض بر اين است که ميکروارگانيسم‌ها با يک توزيع يکنواخت و به طور اتفاقی در نمونه ماده غذايی پخش شده‌اند.

در این روش به بررسی روش به دست آوردن محتمل ترین عدد در کنترل کیفی نمونه آب آشامیدنی پرداختیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.

واژه نامه