آزمون فاکتور X و V: ابزاری کلیدی برای شناسایی گونه‌های Haemophilus
آزمون فاکتور X و V چیست؟
باکتری‌های گونه هموفیلوس (Haemophilus) باسیل‌های کوچک، پلئومورفیک (Pleomorphic)، گرم منفی یا کوکوباسیل‌هایی (Coccobacilli) با آرایش تصادفی هستند که می‌توانند بیماری‌هایی از جمله انفلانزا، سپسیس و مننژیت ایجاد کنند. بنابراین تشخیص آن‌ها در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی اهمیت زیادی در سلامت بیماران دارد.
یکی از آزمون‌های مهم برای تمایز بین گونه‌های هموفیلوس، آزمون فاکتور X و V است. در این مقاله، با اصول، مراحل و کاربردهای این آزمون کلیدی آشنا می‌شوید.
هموفیلوس باکتری‌هایی با نیازهای غذایی خاص
گونه‌های هموفیلوس باسیل‌های کوچک، پلی‌مورف، گرم‌منفی و با آرایش تصادفی هستند.
یکی از گونه‌های مهم بالینی این باکتری، آنفولانزا است که ارگانیسمی سخت‌پسند می‌باشد و بهترین رشد را در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد، همراه با حدود ۵٪ CO₂ و در حضور فاکتورهای رشد کمکی ویژه‌ای به نام فاکتورهای X و V دارد.
آزمون فاکتور X و V چیست و چرا برای رشد هموفیلوس ضروری‌اند؟
اما در آزمون فاکتور X و V ، فاکتورها چه نقشی دارند؟
فاکتور X شامل پروتوپورفیرین IX است که با نام hemin یا سایر پورفیرین‌های حاوی آهن نیز شناخته می‌شود. این ترکیبات برای رشد برخی از باکتری‌ها ضروری‌اند، زیرا سویه‌های وابسته به فاکتور X نمی‌توانند اسید δ-آمینولولینیک را به پروتوپورفیرین IX تبدیل کنند. در مسیر ساخت heme، اسید δ-آمینولولینیک یکی از پیش‌سازهای اولیه است و در مراحل پایانی، پروتوپورفیرین IX با اتصال به آهن به heme تبدیل می‌شود. ازآنجاکه این سویه‌ها این مسیر را کامل نمی‌کنند، باید فاکتور X را از محیط دریافت کنند.
فاکتور V شامل نیکوتین‌آمید آدنین دی‌نوکلئوتید (NAD) یا نیکوتین‌آمید آدنین دی‌نوکلئوتید فسفات (NADP) است؛ مولکول‌هایی که در واکنش‌های متابولیکی سلول نقش کلیدی دارند و برای رشد باکتری‌ها ضروری‌اند.
گونه‌های مختلف جنس هموفیلوس برای رشد در شرایط آزمایشگاهی به فاکتورهای رشد خاصی نیاز دارند. برخی گونه‌ها تنها به فاکتور X، برخی تنها به فاکتور V و برخی به هر دو نیاز دارند. از این تفاوت مهم در نیاز به فاکتورهای رشد میان گونه‌های هموفیلوس می‌توان برای تمایز آن‌ها از یکدیگر استفاده کرد.
هدف از آزمون فاکتور X و V
هدف از انجام آزمون فاکتور X و V تمایز میان گونه‌های هموفیلوس بر اساس ویژگی اختصاصی آن‌ها در استفاده از فاکتورهای رشد X و Vمی باشد.
اصل آزمون: رشد یا عدم رشد، نشانه‌ای از نیاز غذایی باکتری
اعضای جنس هموفیلوس برای رشد در شرایط آزمایشگاهی نیاز به فاکتورهای رشد کمکی دارند. برخی گونه‌ها فقط به فاکتورX ، برخی فقط به فاکتورV و برخی به هر دو نیاز دارند. این تفاوت اساسی در نیاز به فاکتورهای رشد، امکان شناسایی افتراقی گونه‌های مختلف هموفیلوس را فراهم می‌سازد.
در آزمایشگاه، ابتدا باکتری مورد نظر به‌صورت یکنواخت روی محیط‌های کشت مانند هارت اینفیوژن آگار[۱]، تریپتیک سوی آگار[۳]،آگار هموفیلوس[۱] یا نوترینت آگار کشت داده می‌شود. سپس دیسک‌های آغشته به فاکتورهای X ، V و XV به‌طور مستقیم روی سطح محیط کشت قرار می‌گیرند تا این فاکتورها در محیط پخش شوند. باکتری تنها در اطراف دیسکی رشد خواهد کرد که فاکتور لازم برای رشد آن را فراهم می‌کند. بنابراین، حضور یا عدم حضور رشد در اطراف دیسک‌ها معیار شناسایی نیازهای رشد باکتری است.
دیسک‌های آزمون فاکتور X و V: ابزارهای کوچک، نتایج بزرگ
دیسک‌های فاکتور X و V دیسک‌های کاغذی‌ای هستند که با فاکتورهای رشد آغشته شده‌اند.
هر دیسک فاکتور X با hemin آغشته شده است.
هر دیسک فاکتور V با NAD آغشته شده است.
هر دیسک فاکتور XV با ترکیبی از hemin و NAD آغشته شده است.
روش انجام آزمون فاکتور X و V
برای انجام آزمون فاکتور X و V موارد زیر را انجام دهید.
- با استفاده از تکنیک آسپتیک، از کلونی‌های مشکوک، سوسپانسیونی معادل با استاندارد مک‌فارلند ۰٫۵ تهیه کنید.
- سوآب استریل را در سوسپانسیون باکتری فرو ببرید و سطح کامل یک پلیت حاوی Trypticase Soy Agar را با آن آغشته کنید. تلقیح را در سه جهت مختلف با چرخش ۶۰ درجه‌ای پلیت پس از هر بار تلقیح انجام دهید تا رشد یکنواخت حاصل شود.
- اجازه دهید سطح پلیت ۳ تا ۵ دقیقه خشک شود.
- دیسک‌های فاکتور X، V و XV را روی سطح پلیت قرار دهید. در صورت استفاده از دیسک‌های جداگانه، آن‌ها را با فاصله ۴ تا ۵ سانتی‌متری از یکدیگر بگذارید.
- پلیت را در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک شب انکوبه کنید.
- رشد یا عدم رشد اطراف دیسک‌ها را بررسی کنید.
نتایج مورد انتظار: مثبت یامنفی؟
مثبت:
- رشد فقط در اطراف دیسک XV نشان‌دهنده نیاز به هر دو فاکتور X و V است.
- رشد در اطراف دیسکV، نبود رشد در اطراف دیسک X و رشد ضعیف در اطراف دیسک XV نشان‌دهنده نیاز به فاکتور V است.
منفی:
- رشد در سراسر سطح آگار نشان‌دهنده عدم نیاز به فاکتور X یا V است.
محدودیت‌ها و نکاتی که نباید نادیده بگیرید
- برای شناسایی کامل گونه‌ها توصیه می‌شود از روش‌های بیوشیمیایی، ایمنولوژیکی، مولکولی یا طیف‌سنجی جرمی روی کلونی‌های خالص استفاده شود.
- به‌دلیل وجود شباهت‌هایی بین نیازهای فاکتور رشد در گونه‌های مختلف هموفیلوس، نباید تنها به آزمون فاکتور X و V برای شناسایی قطعی گونه‌ها اتکا کرد.
- در حین تلقیح باید مراقب باشید که انتقال مواد مغذی ناخواسته به محیط صورت نگیرد.
سخن پایانی: آزمون فاکتور X و V، گامی مهم اما نه کافی در شناسایی هموفیلوس
آزمون فاکتور X و V یکی از ابزارهای کلیدی در شناسایی افتراقی هموفیلوس است. با وجود دقت بالای آن، نباید تنها به این آزمون اکتفا کرد. در کنار این آزمون، به‌کارگیری روش‌های تکمیلی می‌تواند به شناسایی دقیق‌تر و معتبرتر گونه‌های باکتریایی کمک کند.
واژه نامه
|
Haemophilus Agar |
[۳] | Tryptic Soy Agar | [۲] | Heart Infusion Agar | [۱] |
