مروری بر تست‌های بیوشیمیایی برای تشخیص کوکسی‌های گرم مثبت

تهیه و تنظیم: دکتر محمد قهری

مقدمه:

آزمایشگاه میکروب‌شناسی بالینی نقش مهمی را در تشخیص بیماری‌های عفونی بازی می‌کند. توانایی آزمایشگاه برای ایفای این نقش خود، به کیفیت نمونه جمع‌آوری‌شده از بیمار، چگونگی انتقال از بیمار به آزمایشگاه و روش‌های مورد استفاده برای ردیابی میکروب در نمونه بستگی دارد.

تشخیص آزمایشگاهی بیماری‌های باکتریایی:

ردیابی و شناسایی باکتری‌ها توسط پنج روش رایج در نمونه‌های بالینی صورت می‌گیرد:

• میکروسکوپی
• ردیابی آنتی‌ژن باکتریایی
• ردیابی اسید نوکلئیک اختصاصی باکتری
• کشت
• ردیابی آنتی‌بادی اختصاصی باکتری (سرولوژی)

هرچند بیشتر ارگانیسم‌ها را می‌توان با تکنیک‌های متنوع به‌صورت اختصاصی شناسایی نمود، اما رایج‌ترین روش مورد استفاده در آزمایشگاه تشخیص طبی برای شناسایی و تعیین هویت یک ایزوله (متعاقب کشت) توسط تست‌های بیوشیمیایی صورت می‌گیرد؛ بنابراین با شناخت روش‌ها و تست‌های بیوشیمیایی و با کمک از مورفولوژی میکروسکوپی و ماکروسکوپی می‌توان به وجود عامل بیماری پی برد و آن را شناسایی کرد. در این نوشته تست‌های متنوع و پرکاربرد برای تشخیص کوکسی های گرم مثبت مورد بررسی قرار گیرد.

کوکسی‌های گرم مثبت مجموعه‌ای ناهمگن از باکتری‌ها می‌باشند که خصوصیات مشترک آن‌ها عبارتند از:

1. کروی بودن
2. رنگ‌آمیزی گرم مثبت
3. عدم وجود اندوسپور

محیط کشت مانیتول سالت آگار

این محیط کشت انتخابی برای ایزوله کردن باکتری‌های بیماری‌زای Staphylococci طبق متد‌های هماهنگ‌شده فارماکوپه و استانداردهای ایزو 22718:2006 توصیه شده‌ است. این محیط از درصد بالای نمک و معرف فنول‌رد تشکیل شده است و محیط کشت افتراقی برای تشخیص باکتری‌هایی است که در درصد بالای نمک می‌توانند رشد کنند. این محیط کشت قدیمی برای شمارش و شناسایی Staphylococci می‌باشد. در ضمن بین Staphylococci بیماری‌زا و توانایی آن‌ها برای تخمیر مانیتول رابطه مستقیم وجود دارد. تخمیر مانیتول در نتیجه تجمع تولید اسید پدیدار می‌شود که فنل قرمز را زرد رنگ می‌کند و هاله زرد رنگی اطراف کلنی‌ها که در فرض اولیه بیماری‌زا نیز هستند را دربر می‌گیرد. در حالی‌ که بقیه کلنی‌ها قرمز/نارنجی خواهند بود.

فقط Staphylococci و halophilic enterobacteria می‌توانند در این غلظت نمک در این محیط کشت رشد کنند و بقیه باکتری‌ها قابلیت رشد را در این محیط ندارند.

استافیلوکوک کواگولاز مثبت در این محیط کلونی‌های زرد رنگی تولید می‌کند و استافیلوکک‌های کواگولاز منفی کلنی‌های کوچک و صورتی یا قرمز رنگی تولید می‌کنند و هیچ‌گونه تغییر رنگی در محیط ایجاد نمی‌کنند.

واکنش باکتری‌های بیماری‌زای (+Staphylococci (Coagulase به مانیتول مثبت خواهند بود. کلنی‌های بزرگ با هاله زرد رنگ تولید می‌شود.

باکتری‌های غیربیماریزای (-Staphylococci (Coagulase به مانیتول منفی خواهند بود و کلنی‌های کوچک بدون هاله و یا بدون تغییر رنگ تولید خواهد شد.

باید وجود Coagulase با تکنیک‌های قدیمی آزمون شود تا بتوانیم ثابت کنیم که بیماری‌زا بودن حقیقت بالقوه این مدل باکتری‌ها است.

اولین آزمایش برای تشخیص کوکسی‌های گرم مثبت، انجام تست کاتالاز می‌باشد این تست استافیلوکوک‌ها را از استرپتوکوک‌ها جدا می‌کند. استافیلوکوک‌ها کاتالاز مثبت و استرپتوکوک‌ها کاتالاز منفی هستند.

تست کاتالاز:

یکی از موارد استفاده از این تست برای جداسازی استافیلوکوک‌ها از استرپتوکوک‌ها می‌باشد. استافیلوکوک‌ها کاتالاز مثبت، ولی استرپتوکوک‌ها کاتالاز منفی هستند. آب اکسیژنه یکی از محصولات نهایی متابولیسم اکسیداتیو باکتری‌های هوازی و بی‌هوازی اختیاری است که تجمع آن برای باکتری خطرناک است. آنزیم کاتالاز موجود در باکتری، این ماده خطرناک را به H2O و O2 تجزیه می‌کند.

یک یا دو قطره آب اکسیژنه 3% روی لام ریخته و چند کلونی داخل آن حل می‌کنیم. در صورتی که باکتری کاتالاز مثبت باشد به‌سرعت شروع به تولید O2 می‌کند که به‌صورت حباب‌هایی روی سطح لام مشاهده می‌شود. باید توجه داشت که استفاده از لوپ فلزی ممکن است مثبت کاذب دهد.

چنانچه از محیط بلادآگار استفاده شود، از ریختن آب اکسیژنه به‌طور مستقیم بر روی آن خودداری نموده و حتماً تست را روی لام انجام دهید زیرا گلبول‌های قرمز خود آنزیم کاتالاز دارند و تست به‌صورت مثبت کاذب، خوانده می‌شود. آب اکسیژنه موجود در بازار به‌صورت 30% می‌باشد، بنابراین آب اکسیژنه 3% از فرمول C1V1=C2V2 بدست می‌آید.

  غلظت H2O2 اولیه (30 درصد) =C1

 میزان حجم H2O2 اولیه =V1

 غلظت H2O2 نهایی (3 درصد) =C2

میزان حجمی که از H2O2 3 درصد لازم داریم  =v2

كاتالاز آنزيمي است كه H₂O₂ را به آب و اكسیژن تجزیه می‌کند. H₂O₂ یكی از محصولات نهایی اكسیداسیون در متابولیسم كربوهیدرات است.

این تست به‌منظور:

1. تشخیص استافیلوكوك و میكروكوك (كاتالاز مثبت) از استرپتوكوك (كاتالاز منفی)
2. افتراق كلستریدیوم از باسیلوس‌ها (كاتالاز مثبت)
3. افتراق لیستریا مونوسیتوژنز (كاتالاز مثبت) از استرپتوكوك بتاهمولیتیك

صورت می‌گیرد.

مراحل انجام كار:

1. با یك اپلیكاتور چوبی از مركز یك كلنی به سطح لام شیشه‌ای انتقال می‌دهیم.
2. یک قطره H₂O₂ را بلافاصله به كلنی روی لام اضافه می‌کنیم و ايجاد حباب روی لام بررسی می‌شود.
3. ايجاد حباب‌های سریع و ماندگار با حالت جوش زدن (كف) نشانگر مثبت بودن تست است.

رنگ زرد اطراف کلنی‌های S.aureus به دلیل تخمیر قند مانیتول می‌باشد ولی در استافیلوکوک اپیدرمیدیس به دلیل عدم توانایی تخمیر قند مانیتول، اطراف کلنی‌ها رنگ زرد ایجاد نمی‌شود. این تست در استافیلوکوک ساپروفیتیکوس متغیر است.

برای تشخیص استافیلوکوک اورئوس از سایر استافیلوکوک‌ها می‌توان از تست کوآگولاز استفاده کرد.

• اگر تست کوآگولاز مثبت شد باکتری استافیلوکوک اورئوس می‌باشد.
• اگر تست کوآگولاز منفی شد باکتری استافیلوکوک اپیدرمیدیس و یا استافیلوکوک ساپروفیتیکوس می‌باشد.

برای تشخیص قطعی استافیلوکوک اورئوس از روش‌های زیر استفاده می‌شود:

• کشت روی محیط مانیتول سالت آگار
• تست Dnase
• تست حساسیت به باسیتراسین 4% واحدی و فورازولیدون 100 میکروگرم

S.epidermidis:

یک گونه‌ی غیربیماری‌زا از جنس استافیلوکوک‌ها می‌باشد که فلور طبیعی پوست انسان بوده و به نووبیوسین حساس است. کلنی‌های مات، سفید، مدور و بزرگ بدون همولیز از مشخصات این باکتری می‌باشد.

S.saprophyticus:

این باکتری مولد عفونت مجاری ادراری، مخصوصاً در زنان است که به نووبیوسین مقاوم است.

استرپتوکوک‌ها:

استرپتوکوک‌ها کوکسی‌های گرم مثبتی هستند که مانند زنجیر به دنبال هم قرار می‌گیرند. کاتالاز منفی‌اند و در شرایط بی‌هوازی بهتر رشد می‌کنند و واکنش‌های همولیتیکی بهتری را نشان می‌دهند. برخی روی محیط بلاد آگار باعث لیزشدن گلبول‌های قرمز می‌شوند. بسیاری از استرپتوکوک‌ها پاتوژن‌های مهم انسان هستند که به دلیل وجود سه الگوی مختلف هم‌پوشان، متأسفانه طبقه‌بندی گونه‌ها در این جنس، دشوار است.

طبقه‌بندی استرپتوکوک‌ها معمولاً بر اساس تولید همولیزین روی محیط بلاد آگار است.

• Β همولیتیک: همولیزین محلول تولید می‌کنند و معمولاً منطقه‌ای شفاف و مشخص اطراف کلنی ایجاد می‌کنند مانند استرپتوکوک پیوژنز
• Α همولیتیک: همولیزین محلول تولید نمی‌کنند و منطقه‌ای نیمه‌شفاف و سبزرنگ اطراف کلنی‌ها ایجاد می‌کنند مانند استرپتوکوک ویریدانس
• گاما همولیتیک (بدون همولیز): تغییر قابل مشاهده‌ای را طی رشد روی محیط بلاد آگار ایجاد نمی‌کنند.

البته استرپتوکوک‌ها بر اساس خاصیت آنتی‌ژن هم مورد بررسی قرار گرفته‌اند که بر اساس این طبقه‌بندی که لانسفيلد نامیده می‌شود، استرپتوکوک‌ها به گروه‌های … C ,B ,A تقسیم می‌شوند. وظیفه عمده‌ی یک باکتریولوژیست این است که مشخص کند استرپتوکوک بتا همولیتیک رشد کرده در محیط کشت، استرپتوکوک پیوژنز گروه A است یا جزء گروه دیگری از استرپتوکوک‌هاست، زیرا استرپتوکوک پیوژنز گروه A خاصیت پاتوژنی بیشتری نسبت به سایر گروه‌های استرپتوکوکی دارد.

نمونه‌های مورد آزمایش می‌توانند نمونه گلو، بینی، سواب‌هایی از واژن در موارد تب زایمانی، چرک (عفونت چرکی) یا خون (عفونت خون) باشند.

تشخیص باکتری:

ابتدا پلیت موردنظر را از نوع همولیز ایجادشده بررسی می‌کنند. در موارد ایجاد آلفاهمولیز، به دو گروه ویریدانس و پنوموکک مشکوک و در صورت ایجاد β همولیز، به گروه A و B مشکوک می‌شویم. البته این روش زیاد نیز دقیق نیست، چون بعضی از باکتری‌های β همولیتیک مثل آگالاکتیه، همولیز β واضح نشان نمی‌دهند، بنابراین می‌توان از تست حساسیت به SXT (سولفامتوکسازول و تری‌متوپریم) استفاده کرد که در این تست، گروه A و B به SXT مقاوم بوده ولی سایر گروه‌ها حساس‌اند.

گروه A (پیوژنز):

• کاتالاز منفی
• حساس به باسیتراسین
• توانایی هیدرولیز PYR

گروه B (آگالاکتیه):

معمولاً به‌صورت سپتی‌سمی و مننژیت در نوزادان تظاهر می‌یابد که منبع عفونت بیش‌تر مادر نوزاد می‌باشد. همانطور که قبلاً گفته شد، گروه B همولیز واضحی همانند گروه A، نشان نمی‌دهند و گاهی اوقات نیز همولیز آلفا ایجاد می‌کنند و در برخی موارد گاما همولیتیک هستند.

برای تشخیص قطعی استرپتوکوک‌های گروه B می‌توان از روش‌های زیر استفاده کرد:

• تست CAMP
• تست هیدرولیز هیپورات سدیم

تست CAPM:

برای شناسایی احتمالی گروه B صورت می‌گیرد. تست CAMP مخفف نام افرادی است که این تست را برای نخستین بار ابداع کردند که شامل Christie-Atkins-Munch-Petersen می‌باشد.

واکنش CAMP

اساس واکنش نشان دادن خصوصیات سینرژیستیک بین رها شدن ماده خارج سلولی در حین رشد از استرپتوکوک گروه B و واکنش آن با بتاتوکسین استافیلوکوک اورئوس است که سبب افزایش همولیز در استافیلوکوک اورئوس می‌شود. این واکنش در بعضی از انواع کورینه باکتریوم وجود دارد و به شکل دیگری در لیستریا منوسیتوژنز و ویبریو کلره التور دیده می‌شود. برای انجام آن به استافیلوکوک ATCC 25923 نیاز است.

این آزمایش به سه روش انجام می‌شود:

1. استفاده از سوش‌های aureus تولیدکننده بتا همولیزین
2. دیسک‌های حاوی بتا همولیزین
3. بتا همولیزین استخراج‌شده از استافیلوکوک اورئوس

همولیز بتا، در محلی که دو سویه استاف اورئوس و استرپتوکوک گروه B به هم نزدیک می‌شوند، تشدید می‌شود و شبیه به نوک پیکان دیده می‌شود و در این صورت تست CAMP مثبت می‌شود.

روش سوم به این صورت است که اگر یک قطره از بتا همولیزین استخراج‌شده از استافیلوکوک اورئوس، روی محیط کشت استرپتوکوکی ریخته شود، بعد از 20 دقیقه انکوبه کردن در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، شدت همولیز به‌خوبی قابل مشاهده می‌گردد.

هیدرولیز سریع هیپورات سدیم:

این باکتری می‌تواند هیپورات سدیم را هیدرولیز کرده و اسید بنزوئیک و گلیسین تولید کند. گلیسین توسط عامل اکسیدکننده‌ای به نام نین‌هیدرین، دی‌آمینه شده، احیا می‌شود و تولید رنگ بنفش می‌کند.

استرپتوکوک ویریدانس (strep.viridans):

اکثر باکتری‌های این گروه همولیز ناقص روی پلیت بلاد آگارایجاد می‌کنند (آلفا همولیتیک). فلور طبیعی دهان و حلق هستند و به علت ارتباط آن‌ها با عفونت دندان وآندوکاردیت باکتریایی حاد، اهمیت کلینیکی ویژه‌ای دارند. این باکتری‌ها در خون، زخم‌های بسته و آبسه‌ها نیز یافت می‌شوند.

روش تشخیص:

• نسبت به اپتوچین مقاوم هستند. این ویژگی، این باکتری‌ها را از استرپتوکوک پنومونیه متمایز می‌سازد.
• عدم حلالیت در صفرا
• عدم رشد در محلول NaCl شش و نیم درصد (6/5 درصد)

انتروکوک و استرپتوکوک گروه D نیز ممکن است با این گروه اشتباه گرفته شوند. عدم رشد در NaCl شش و نیم درصد (6/5 درصد) می‌تواند آن‌ها را از انتروکوک متمایز سازد.

استرپتوکوک گروه D:

این گروه از باکتری‌ها می‌توانند آندوکاردیت، عفونت دستگاه ادراری، آبسه‌ها و عفونت‌های زخم را ایجاد کنند. این گروه ویژگی‌های خاصی دارند که در زیر به بخشی از آن‌ها اشاره می‌شود:

• تست بایل اسکولین آن‌ها مثبت است.
• نسبت به پنی‌سیلین حساس هستند درحالی‌که انتروکوک‌ها مقاوم‌اند.
• در محیط حاوی NaCl شش و نیم درصد رشد نمی‌کنند.
• تست PYR آن‌ها منفی است ولی این تست در انتروکوک‌ها مثبت می‌باشد.

در بعضی از گونه‌ها برای تمایز این گروه از استرپتوکوک ویریدانس نمی‌توان تنها بر اساس خصوصیات بیوشیمیایی تصمیم گرفت و باید سروتایپینگ صورت بگیرد.

استرپتوکوک فکالیس یا انتروکوک (strep.faecalis):

این باکتری معمولاً به‌صورت غیرهمولیتیک روی محیط بلاد آگار دیده می‌شود و عامل عفونت‌های مجاری ادراری و آندوکاردیت به‌ویژه در سالمندان می‌باشد. در زیر به بخشی از ویژگی‌های این گروه اشاره شده است:

• فاقد حرکت و بدون کپسول می‌باشند.
• روی محیط مکانکی به‌صورت کلنی‌های کوچک صورتی رنگ دیده می‌شوند.
• حرارت 60 درجه سانتی‌گراد را به مدت 30 دقیقه تحمل می‌کنند. (این ویژگی آن‌ها را از سایر استرپتوکوک‌ها متمایز می‌کند)
• قند مانیتول را تخمیر کرده و گاز تولید می‌کنند.
• تست بایل اسکولین آن‌ها مثبت می‌باشد.
• تست PYR آن‌ها مثبت است.
• قادر به رشد در محیط حاوی NaCl شش و نیم درصد هستند.

نکته مهم در رابطه با این گروه آن است که ممکن است تست کاتالاز آنها مثبت خیلی ضعیف شود.

استرپتوکوک پنومونیه یا پنوموکوک (pneumococcus):

به‌صورت دیپلوکوک‌های گرم مثبت، شعله‌ای شکل یا بیضی شکل دیده می‌شوند که انتهای مسطح آن‌ها در مقابل هم قرار می‌گیرد.

این باکتری‌ها در آزمایشگاه بعد از کشت‌های متناوب بدون کپسول می‌شوند، درحالی‌که در نمونه‌ی اولیه مریض دارای کپسول می‌باشند، بنابراین برای نگهداری آن‌ها در آزمایشگاه باید آن‌ها را به یک حیوان خاص مثل موش تلقیح کرد. به برخی از ویژگی‌های این باکتری در زیر اشاره شده است.

• دارای همولیز ناقص است، بنابراین اطراف کلنی‌ها رنگ سبز ایجاد می‌شود که در محیط شکلات آگار بهتر دیده می‌شود.
• نسبت به اپتوچین حساس است.
• قادر به تخمیر اینولین می‌باشد.
• تست حلالیت در صفرا در آن‌ها مثبت می‌باشد.
• یکی از تست‌هایی که امروزه کمتر برای شناسایی این گروه مورد استفاده قرار می‌گیرد، تست کوالانگ است. (تست تورم کپسولی)

از این واکنش می‌توان برای شناسایی مستقیم ارگانیسم در نمونه خلط، مایع CSF و سایر نمونه‌ها استفاده کرد. در این تست سرم پنوموکوک و متیلن‌بلو را با نمونه بالینی یا کشت باکتری ترکیب می‌کنند و سپس نمونه را با عدسی 100 مورد بررسی قرار می‌دهند. زمانی که باکتری موردنظر با آنتی‌بادی واکنش دهد و کپسول آن متورم شود نتیجه تست مثبت می‌شود.

واژه‌نامه: