رنگ‌آمیزی کپسول باکتریایی

رنگ‌آمیزی کپسول باکتریایی، نوعی رنگ‌آمیزی افتراقی است که از رنگ‌های اسیدی و بازی برای رنگ‌آمیزی زمینه و سلول‌های باکتریایی استفاده می‌کند تا حضور کپسول به راحتی قابل مشاهده باشد. کپسول باکتری ساختار بزرگی است که در بسیاری از باکتری‌ها وجود دارد.

 کپسول باکتری یک لایه پلی‌ساکارید است که خارج از پوشش سلولی قرار دارد و بنابراین بخشی از پوشش بیرونی یک سلول باکتریایی در نظر گرفته می‌شود. این لایه به راحتی از بین نمی‌رود و در برابر فاگوسیتوز مقاومت می‌کند و در نتیجه می‌تواند عامل بیماری‌های مختلف باشد. به همین دلیل شناسایی کپسول باکتریایی در آزمایشگاه از اهمیت بالایی برخوردار است. در این مطلب قصد داریم به بررسی تکنیک رنگ‌آمیزی کپسول باکتریایی بپردازیم.

اصول رنگ‌آمیزی کپسول باکتریایی

کپسول باکتریایی هم در باکتری‌های گرم منفی و هم در باکتری‌های گرم مثبت یافت می‌شود. این بخش از باکتری در سیتوپلاسم سنتز می‌شود و سپس به خارج از سلول ترشح می‌گردد. کپسول در اکثر باکتری‌ها، از یک لایه پلی‌ساکارید (polysaccharide) تشکیل شده است، اما برخی از باکتری‌ها نیز دارای کپسولی هستند که از پلی‌پپتید (polypeptide) یا گلیکوپروتئین (glycoprotein) تشکیل شده است.

رنگ‌های اسیدی و بازی به سطح کپسول‌های باکتریایی نمی‌چسبند. به همین دلیل بهترین روش برای بررسی آن‌ها، رنگ‌آمیزی پس زمینه با استفاده از یک رنگ اسیدی (به عنوان مثال، نیگروسین^[1] و کنگو رد^[2]) و رنگ آمیزی خود سلول با استفاده از یک رنگ بازی (مانند کریستال ویول^[3]، سافرانین^[4]، فوشین بازی^[5] و متیلن بلو^[6]) است.

انواع مختلفی از روش‌ها برای نشان دادن وجود کپسول در نمونه‌ی گرفته شده از بیماران وجود دارد که در ادامه قصد داریم به بررسی دو مورد از رایج‌ترین آن‌ها بپردازیم.

۱. روش جوهر هند (India ink)

در این روش از دو رنگ کریستال ویوله و جوهر هند استفاده می‌شود. پس از رنگ‌آمیزی، کپسول به صورت هاله‌ای شفاف در اطراف میکروارگانیسم دیده می‌شود. این روش برای نشان دادن کریپتوکوکوس (Cryptococcus) متداول است.

در رنگ امیزی کپسول به روش جوهر هند یا ایندیا اینک، پس زمینه‌‎‌ سیاه بوده و سلول‌های باکتری به رنگ بنفش رنگ می‌شوند.

کپسول (در صورت وجود) در پس زمینه تیره شفاف به نظر می‌رسد.

توجه: کپسول هیچ رنگی نمی‌گیرد.

نکته: برخی محققین از نیگروسین به جای جوهر هند استفاده می‌کنند و معتقد هستند نیگروسین پس زمینه یکنواخت‌تری را ارائه می‌دهد.

۲. روش رنگ آمیزی آنتونی (Anthony’s stain method)

در این نوع رنگ آمیزی کپسولی، ابتدا از رنگ کریستال ویوله استفاده می‌شود. به این ترتیب تمام قسمت‌های سلول باکتریایی بنفش رنگ می‌شوند. سپس محلول سولفات مس 20 درصد به عنوان رنگ‌زدا و ضد لکه افزوده می‌شود. این کار باعث می‌شود تا رنگ بنفش کریستال ویوله شسته شود. به این ترتیب کپسول را بی‌رنگ شده و به صورت هاله آبی کم رنگ در اطراف یک سلول بنفش قابل مشاهده خواهد بود.

مواد و معرف های مورد نیاز برای رنگ‌آمیزی کپسول باکتری

۱. باکتری‌های آزمایشی:

 ۲. کشت 36 الی48 ساعته از باکتری مورد آزمایش مانند کلبسیلا پنومونیه روی اسلنت آگارء EMB ^[7]

توجه: کشت کلبسیلا پنومونیه در محیط‌های مبتنی بر شیر (مانند شیر بدون چربی) اندازه کپسول را افزایش داده و تجسم را آسان‌تر می‌کند.

۳. محلول‌های رنگ‌آمیزی

 بسته به نوع روش مورد استفاده (کریستال ویوله، جوهر هند، نیگروسین، سولفات مس، محلول بیسیک کاربول فوشین، محلول متیلن بلو و غیره).

۴. لام میکروسکوپ

۵. لوپ

۶. میکروسکوپ با عدسی شیئی 100x

۷. روغن ایمرسیون

۸. چراغ بونزن

۹. دستمال

مراحل رنگ‌آمیزی کپسول باکتریایی

در ادامه‌ به مرور مراحل رنگ آمیزی کپسول باکتریایی خواهیم پرداخت.

الف- رنگ‌آمیزی کپسول- جوهر هند

۱. یک قطره جوهر هند را روی یک لام میکروسکوپ تمیز، در مجاورت لبه مات لام، قرار دهید.

۲. لوپ را روی شعله نگه دارید تا رنگ آن قرمز شده و استریل شود. با استفاده از لوپ استریل مقداری کلبسیلا پنومونیه را از لوله یا پلیت حاوی کشت باکتریایی بردارید و آن را با قطره جوهر هند مخلوط کنید. مطمئن شوید که مقدار زیادی از کشت باکتریایی برنداشته‌اید و سعی کنید از پخش شدن قطره جلوگیری کنید.

۳. انتهای یک لام میکروسکوپ تمیز دیگر را با زاویه‌ در انتهای لام حاوی ارگانیسم قرار دهید و قطره را به کمک لام، پخش کنید. (همانطور که گسترش خون محیطی را روی لام ایجاد می‌کنید)

۴. اجازه دهید فیلم در هوا خشک شود (حدود 5 الی7 دقیقه صبر کنید). توجه داشته باشید که با استفاده از گرما رنگ را خشک نکنید.

۵. لام را به مدت 1 دقیقه در رنگ کریستال ویوله غوطه‌ور کنید. پس از گذشت این زمان لام را خیلی آرام با آب بشویید. مراقب باشید زیرا آب ممکن است کپسول را از سلول خارج کند.

۶. اجازه دهید لام خشک شود و سپس آن را زیر میکروسکوپ با استفاده از روغن ایمرسیون بررسی کنید.

نتایج: به دنبال سلول‌های بنفش باشید که توسط هاله‌ای شفاف روی پس‌زمینه تیره احاطه شده‌اند. هاله همان کپسول است. ممکن است لازم باشد مقدار نور را کاهش دهید تا کپسول راحت‌تر دیده شود.

ب- رنگ‌آمیزی کپسول- روش رنگ آمیزی آنتونی

۱. یک قطره از رنگ کریستال ویوله را روی یک لام میکروسکوپ تمیز، در مجاورت لبه مات لام، قرار دهید.

۲. لوپ را روی شعله نگه دارید تا رنگ آن قرمز شده و استریل شود. با استفاده از لوپ استریل سه حلقه از باکتری آزمایشی (هر گونه باکتری کپسوله شده مانند کلبسیلا پنومونیه، استرپتوکوک پنومونیه) را از کشت آبگوشت روی لام قرار دهید.

۳. انتهای یک لام میکروسکوپ تمیز دیگر را با زاویه ای نسبت به انتهای لام حاوی ارگانیسم قرار دهید و قطره را به صورت فیلم پخش کنید.

۴. اجازه دهید فیلم در هوا خشک شود (حدود 5 الی7 دقیقه صبر کنید). توجه داشته باشید که با استفاده از گرما رنگ را خشک نکنید.

۵. لام را کج کرده و با محلول 20% سولفات مس شستشو دهید.

۶. توجه: لام را با آب شست و شو ندهید زیرا آب ممکن است کپسول را از سلول خارج کند.

۷. چند دقیقه صبر کنید تا لام خشک شود و سپس آن را زیر میکروسکوپ با استفاده از روغن ایمرسیون بررسی کنید.

نتایج: به دنبال سلول‌های بنفش باشید که با هاله آبی روشن یا کم‌رنگ در پس‌زمینه شفاف احاطه شده‌اند. هاله کپسول است. ممکن است لازم باشد مقدار نور را کاهش دهید تا کپسول راحت‌تر دیده شود.

واژه نامه: