روش رنگ‌آمیزی کریستال ویوله LIEB برای نمایش دادن آمیلوئیدها
کریستال ویوله یک نمک کلرید آلی است که به دسته رنگ‌های قلیایی تری‌فنیل‌متان تعلق دارد.
این نمک مونوکلراید که نام علمی آن هگزامتیل کلراید آنیلین رز [1] است، کاربردهای زیستی و صنعتی گسترده‌ای دارد که از این کاربردها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
- به عنوان جوهر یا برای ثبت اثر انگشت
- به عنوان یک ماده ضد قارچ، ضد باکتری و ماده ضد التهاب
- به عنوان یک رنگ هیستولوژی برای رنگ‌آمیزی بافت
این نمک به شکل پودری وجود دارد و رنگ آن در حالت پودری سبز تیره با براقیت فلزی است اما هنگام حل شدن در آب یا الکل به رنگ بنفش درمی‌آید. میزان تیرگی و روشنی (تنالیته) رنگ بنفش، به میزان اسیدیته محلول مورد نظر بستگی دارد. ایجاد رنگ بنفش تیره یا روشن به دلیل بارهای مختلف موجود در مولکول‌ها می‌باشد.
کریستال ویوله با نام‌های دیگری نیز شناخته می‌شود. اسامی مترادف کریستال ویوله عبارتند از:
Basic Violet 3، Gentian Violet، Hexamethyipararosaline chloride، Methyl Violet 10B
در این مقاله قصد داریم رنگ‌آمیزی آمیلوئیدها با استفاده از کریستال ویوله LIEBء[2] را بیان کنیم اما پیش از آن لازم است با تاریخچه این رنگ بیشتر آشنا شوید.
تاریخچه
رنگ کریستال ویوله یکی از اجزای متیل ویوله است. کریستال ویوله ابتدا توسط آلفرد کرن [3] ساخته شد. او برای سنتز این محلول با یک شیمی‌دان آلمانی به نام هنریش کارو [4] همکاری کرد.
جاکوب استیلینگ، چشم‌پزشک آلمانی، در سال 1890 خواص ضدعفونی کننده کریستال ویوله را کشف کرد. بعدها در سال 1902 کنرادی و دریگالسکی [5] متوجه شدند که این رنگ روی باکتری‌های گرم مثبت تاثیر زیادی دارد و اثر آن روی باکتری‌های گرم منفی مانند سالمونا تیفی بسیار کم است.
مواد مورد نیاز:
فیکساتیو: بافر فرمالین %۱۰ (خنثی)
محلول‌های مورد نیاز:
۱- محلول کریستال ویوله
| مواد مورد نیاز | مقدار مواد مورد نیاز |
| رنگ کریستال ویوله C.I. 42555 | ۱/۴ گرم |
| الکل %۹۵ | ۱۰ میلی‌لیتر |
| آب مقطر | ۳۰۰ میلی‌لیتر |
| اسید کلریدریک غلیظ | ۱ میلی‌لیتر |
۲- محلول مانت (پوشاننده) Apathy
| مواد مورد نیاز | مقدار مواد مورد نیاز |
| آکاسیا (صمغ عربی اقاقیا) [6] | ۵۰ گرم |
| ساکارز (شکر) | ۵۰ گرم |
| آب مقطر | ۱۵۰ میلی‌لیتر |
| سدیم کلرید | ۱۰ گرم |
| تیمول | ۰/۱ گرم |
صمغ عربی اقاقیا (ساکارز و آب مقطر را با استفاده از یک هات پلیت در یک بشر ۵۰۰ میلی‌لیتری مخلوط کنید. محلول را در دمای ۵۸ تا ۶۰ درجه سانتی‌گراد گرم کنید. معمولا ۵ الی ۶ ساعت طول می‌کشد تا Acacia به طور کامل در محلول حل شود. در صورت نیاز برای حفظ حجم محلول، به آن آب مقطر اضافه کنید. سدیم کلراید و تیمول را در محلول حل کنید سپس محلول را به وسیله کاغذ صافی‌های پشم شیشه‌ای [7] فیلتر کنید.
شکل ۱: کاغذ صافی پشم شیشه‌ای
محلول به دست آمده را در یخچال و در دمای ۳ تا ۶ درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید. سدیم کلراید باعث جلوگیری از انتشار می‌شود. تیمول نیز به عنوان ماده نگهدارنده به محلول اضافه می‌شود.
تکنیک رنگ‌آمیزی:
بافت‌های پارافینی را در اندازه‌های ۶ میکرومتری برش دهید.
مراحل رنگ‌آمیزی:
برای این رنگ‌آمیزی از لام‌های کنترلی استفاده کنید.
۱- بافت را دپارافینه کنید سپس هیدراسیون با آب مقطر را انجام دهید.
۲- لام‌ها را با محلول کریستال ویوله رنگ‌آمیزی کنید و اجازه دهید رنگ به مدت ۵ دقیقه روی آن باقی بماند.
۳- لام‌ها را به مدت ۵ دقیقه زیر شیر آب شست و شو دهید و سپس آن‌ها را با آب مقطر بشویید.
۴- لام‌ها را با محلول مانت (پوشاننده) Apathy بپوشانید و لامل را روی آن‌ها قرار دهید.
نتایج
| پروتئین/ بافت | رنگ مشاهده شده |
| آمیلوئید | بنفش ارغوانی |
| سایر عناصر بافت | آبی |
دو نمونه از نتایج رنگ‌آمیزی بافت‌ها با رنگ کریستال‌ویوله را در زیر آورده‌ایم:
شکل ۲: آمیلوئید رنگ‌آمیزی شده با کریستال‌ویوله
شکل ۳: رشد بیش از حد سلول‌های کلنی (ES) در لایه تغذیه‌ای فیدر، بعد از رنگ آمیزی با رنگ کریستال ویوله. (بزرگنمایی 40X)
توضیحات:
* از آنجا که برای ساخت محلول مانت (پوشاننده) Apathy علاوه‌بر فرمول اصلی، ساکارز و سدیم کلرید نیز به آن اضافه شده است، انتشار رنگ در آن رخ نمی‌دهد.
*در این روش (رنگ‌آمیزی با محلول کریستال‌ویوله) همه انواع آمیلوئیدها مانند روش کنگو‌رد [۸]، رنگ‌آمیزی نمی‌شوند اما این روش معمولا آمیلوئیدهای موجود در عضله‌ی قلب را بهتر از روش کنگو‌رد نشان می‌دهد.
واژه‌نامه
| Alfred Kern | [3] | LIEB CRYSTAL VIOLET | [2] | hexamethyl chloride rose aniline | [1] |
| Acacia (gum arabic) | [6] | Conradi and Drigalski | [5] | Heinrich Caro | [4] |
| Puchtler’s Congo red technique | [8] | glass wool fiber | [7] |
