روش‌های شیمیایی شناسایی آنتروباکتریاسه‌ها (3): اشریشیا کلی

ترجمه و تنظیم: دکتر محمد قهری

جنس اشریشیا  

جنس اشریشیا گونه‌های مختلفی دارد که از انسان جدا می‌گردند (جدول1). اشریشیا آلبـــرتی (E. albertii) از مدفوع اسهالی کودکان ایزوله می‌شود و لاکتوز و سوربیتول منفی بوده و اغلب کارکنان آزمایشگاه آن را با هافنیا آلوئی اشتباه می‌گیرند. اشریشیا فرگوسنی (E. fergusonii) اغلب از خون، ادرار‌، مثانه و مدفوع ایزوله می‌گردد و لاکتوز و سوربیتول منفی است. اشریشیا هرمانی (E. hermannii‌) اغلب از زخم‌، خلط، CSF، مایع پلور، خون و مدفوع ایزوله می‌شود و همانند E. coli O157 سوربیتول منفی است. اشریشیا ولنریس (E. vulneris‌) اغلب از زخم بازوها و ساق پاها و از باکتریمی ناشی از کاتتر ایزوله می‌شود.

ایندول و سوربیتول منفی است. اشریشیا بلاته (E. blattae) اغلب با عفونت‌های انسانی در ارتباط نیست.

اشریشیا کلی

اشریشیا کلی باکتری بی‌هوازی اختیاری و بخشی از فلور نرمال روده انسان و حیوانات است. این باکتری بر روی محیط‌های خیلی ساده به‌آهستگی رشد می‌کند، متحرک با فلاژل‌های پری‌تریش است، لاكتوز را تخمیر كرده و بر روی ائوزین متیلن بلو ایجاد جلای فلزی سبزرنگ می‌کند، دارای فعالیت دكربوكسیلاسیون لیزین است و سیترات را به‌عنوان تنها منبع كربن می‌تواند استفاده كند و تریپتوفان را هیدرولیز و ایجاد ایندول می‌نماید. آزمایشگاه‌های رفرانس سویه‌های خاص اشریشیا كلی را با سروتایپ آنتی‌ژن‌های K ،H ،O تشخیص می‌دهند. آنتی‌ژن O، آنتی‌ژن سوماتیک دیواره سلولی یا همان اندوتوکسین باکتری‌های گرم منفی است. صدها آنتی‌ژن O از این باکتری شناسایی شده است. آنتی‌ژن O، مقاوم به حرارت است.

آنتی‌ژن H، مربوط به فلاژل باکتری می‌شود. آنتی‌ژن K شامل ساختارهای سطحی باکتری از قبیل فیمبریه، تاژک، پروتئین‌های غشای خارجی و پلی‌ساکارید کپسولی بوده و میزان آن در شرایط مختلف رشد متفاوت است. آنتی‌ژن‌های K به سه گروه تقسیم‌بندی شده‌اند (L، A و B). یك مثال سویه تیپیك اشریشیا كلی به‌صورت H11ء: (E.coli O26:K60(B6 نمایش داده می‌شود. بیشتر بیماری‌های اشریشیا كلی عفونت‌های فرصت‌طلب در کلیه، مثانه، زخم، ریه یا مننژ هستند كه هر كدام می‌توانند به سپسیس كشنده منجر شوند، بنابراین اشریشیا كلی یكی از پاتوژن‌های كلیدی عفونت‌های بیمارستانی است. البته اشریشیا كلی می‌تواند به عفونت‌های مجاری ادراری اكتسابی نیز منجر شود و سویه‌های خاصی از آن نیز عامل اسهال عفونی هستند كه این سویه‌ها را به‌صورت انتروتوكسیژنیک (^[1]ETEC)، انتروپاتوژنیك (^[2]EPEC)، انترواینوازیو (^[3]EIEC) و انتروهموراژیك (^[4]EHEC) دسته‌بندی می‌کنند، بعلاوه، چون سویه‌های EHEC تولید وروتوكسین می‌کنند گاهی اوقات آن‌ها را سویه‌های وروتوكسیژنیك (^[5]VTEC) نیز می‌نامند.

بیماری‌زایی:

باكتری اشریشیا كلی به تعداد زیادی در روده تمام انسان‌ها یافت می‌شود و به‌واسطه آلودگی مدفوعی پراكنده می‌گردد. مطالعات نشان داده است كه در بیماران بستری در بیمارستان، تعداد عفونت‌های مهاجم به‌ موازات شیوع عفونت‌های اشریشیا كلی افزایش یافته است. برای مثال، برخی بیماران دیابتی معمولاً در طول استفاده از وسایلی نظیر كاتتر در اثر تماس با اشریشیا كلی آلوده می‌گردند. از عوامل مؤثر در ایجاد مننژیت نوزادان توسط اشریشیا كلی می‌توان به زایمان همراه با تروما، تولد زودرس، وزن كم در زمان تولد و استفاده از وسایل كمك زایمان آلوده اشاره كرد. عفونت مجاری ادراری اكتسابی حاصل از اشریشیا كلی معمولاً به‌صورت خودآلودگی^[6] است و اغلب در زنان روی می‌دهد، چون مجرای ادراری در زنان كوتاه است، كلی فرم‌ها در واژن مستقر می‌گردند. اشریشیا كلی به‌راحتی می‌تواند در مجرای ادراری به سمت مثانه و كلیه بالا برود. سیستیت در زنانی كه به‌تازگی ازدواج‌کرده‌اند (سیستیت ماه‌عسل^[7]) بسیار شایع است. در مردان بالای 45 سال، هیپرتروفی پروستات از عوامل خطر عفونت مجاری ادراری است. سایر عوامل خطر در زنان و مردان  شامل  دیابت و سنگ كلیه می‌باشند. بیمارانی كه توسط اشریشیا کلی دچار عفونت‌های مجاری ادراری می‌شوند، تظاهرات سیستیت، پیلونفریت یا سپسیس دارند.

سیستیت عفونت مثانه است كه معمولاً با تكرر ادرار و اشكال در ادرار كردن همراه است و بیماران ندرتاً تب و درد پهلو دارند. برخلاف آن، پیلونفریت عفونت پارانشیم كلیه و لگن است كه غالباً با تب، درد پهلو تكرر ادرار و اشكال در ادرار كردن همراه است. گاهی اوقات بیماران دچار لرز، تهوع، استفراغ، اسهال، لكوسیتوز با شیفت به چپ و باكتریمی نیز می‌گردند. پیلونفریت فاكتور خطر مهمی برای سپسیس خصوصاً در بیماران جوان‌تر است. سپسیس كه با عبور باكتری اشریشیا کلی از مجاری ادراری به  سیستم گردش خون روی می‌دهد، از موارد اورژانس پزشكی با میزان مرگ‌ومیر بالا است.

سیستیت و پیلونفریت با گرفتن نمونه ادرار میانی (با رعایت موارد مهم در نمونه‌گیری) و آزمایش و كشت آن تشخیص داده می‌شوند. ادرار مبتلایان به سیستیت حاوی RBC،ء WBC و باكتری است و در آزمایش آنتی‌بادی فلورسنت، باكتری با آنتی‌بادی پوشیده می‌شود.

در اکثر بیماران مبتلا به سیستیت و در بیش از 80 تا 90 درصد بیماران مبتلا به پیلونفریت ساده، اشریشیا کلی عامل بیماری‌زا است. سایر عوامل سیستیت شامل استافیلوكوكوس ساپروفیتیكوس و انتروكوكوس فكالیس و سایر عوامل پیلونفریت نیز شامل پروتئوس میرابیلیس، پروتئوس ولگاریس و انتروكوك‌ها می‌باشند.

الف) اشریشیاكلی انتروتوكسیژنیک:

اشریشیاكلی انتروتوكسیژنیك عامل معمول اسهال عفونی آبكی در نوزادان دچار سوءتغذیه و عامل اصلی اسهال مسافرین است. عفونت با خوردن آب یا غذای آلوده به مدفوع كسب می‌شود. ETEC در ناحیه پاروكسیمال روده كوچك مستقر شده، از طریق پیلی به مخاط آن ناحیه چسبیده و تولید سم ST یا LT می‌کند. ST یا LT سبب ترشح بیش از حد مایعات و الکترولیت‌ها شده كه منجر به اسهال آبكی می‌گردد. عفونت ETEC با تظاهرات اسهال آبكی، تهوع، كرامپ شكم و تب پایین در افراد مشخص می‌گردد.

ب) اشریشیاكلی انتروپاتوژنیك:

اشریشیاكلی انتروپاتوژنیك عامل اپیدمی نوزادان، خصوصاً نوزادانی است كه در شهرها زندگی می‌کنند یا در بیمارستان بستری هستند. ندرتاً در افراد بالای یکسال ایجاد اسهال عفونی می‌کند و تقریباً همه بیماران 6 ماهه یا کوچک‌تر هستند. گاهی اپیدمی EPEC در مهدکودک‌های ایالات متحده رخ داده و گاهی عامل اسهال‌های طولانی‌مدت می‌گردند و با تظاهرات اسهال آبكی، تب، درد، استفراغ و مدفوع مملو از موكوس بدون خون در افراد مشخص می‌شود.

باكتری EPEC با مكانیسم Localized adherence محكم به غشاء انتروسیت می‌چسبد. علاوه بر پوشاندن سلول‌ها به‌صورت یكسان، باكتری از طریق پیلی تیپ IV به‌صورت میكروكلنی‌های مجزا به اپیتلیوم اتصال می‌یابد. در فرآیندی كه توسط ژن‌های كروموزومی و پلاسمیدی كنترل می‌شود، باكتری سبب افزایش كلسیم داخل سلول‌های هدف شده و سبب محو میكروویلی می‌گردد. ادهیسین دیگری بنام اینتیمین^[8] وجود دارد كه سبب اتصال محكم به انتروسیت می‌شود و سبب می‌گردد كه در زیر هر باكتری متصل به مخاط، رشته‌های اكتین پرولیفره شود.

گاهی اوقات EPEC به سلول تهاجم می‌کند ولی این تهاجم به اندازه EIEC گسترده نیست. در این فرآیند ممكن است میكروویلی‌ها تخریب شده و سبب مقداری سوء جذب شوند، اما عامل دقیق اسهال در اثر EPEC مشخص نیست و اسهال حاصل از EPEC آبكی و موكوئیدی است و در مدفوع خون دیده نمی‌شود.

ج) اشریشیاكلی انتروهموراژیك:

مخزن اولیه این باکتری گوساله است و اسهال عفونی حاصل از EHEC از گوشت یا همبرگر نیم‌پزی حاصل می‌شود كه آلوده به مدفوع گاو است. اسهال EHEC در ایالات متحده بطور عمده توسط سویه O157:H7 و در كانادا و  شمال غربی پاسیفیک با سویه O26:H11 سویه 30 مرتبط است. موارد تک‌گیر از خانه سالمندان و مهدکودک‌ها گزارش می‌شود. اسهال عفونی ناشی از EHEC با چسبیدن باكتری به مخاط كولون و تولید وروتوكسین روی می‌دهد. اسهال حاصله، خونی است ولی تفاوتش با دیسانتری این است كه در مدفوع PMN دیده نمی‌شود. عفونت EHEC سبب اسهال آبكی و درد شكم در 4 روز بعد از ورود باكتری EHEC به روده بیمار می‌گردد. در حدود 40 درصد از بیماران در روز پنجم به اسهال خونی مبتلا می‌شوند. این اسهال به کولیت هموراژیك معروف است و با درد شكمی فراوان، ولی اغلب بدون تب همراه است. در 11 درصد از بیمارانی كه به کولیت هموراژیك مبتلا می‌شوند به‌زودی علائم سندرم اورمی همولیتیك ظاهر می‌گردد. اسهال EHEC به‌خودی‌خود خطرناك است، اما خطرناک‌تر از آن، حالتی است كه در 2 تا 11 درصد موارد منجر به سندرم اورمی همولیتیك می‌گردد. EHEC همانند EIEC اسهال خونی می‌دهد. دوز عفونی EHEC همانند دوز عفونی شیگلاها پایین (100 عدد باکتری) است.

د) اشریشیاكلی انترواینوازیو:

باكتری EIEC بیشتر در كشورهای توسعه‌یافته حضور دارد و ندرتاً در ایالات متحده دیده می‌شود. انتقال EIEC از طریق غذا و آب آلوده به مدفوع است. آن‌ها به مخاط كولون متصل شده، سپس به مخاط و لامینا پروبریا حمله می‌کنند. اگرچه این امر ابتدا سبب اسهال آبكی می‌شود، ولی بعد از مدتی اسهال شبه‌ دیسانتری داده و در مدفوع خون و موكوس یافت می‌شود.

ه) اشریشیاكلی انترواگریگیتیو^[9]

در سال‌های اخیر محققین سویه‌هایی از اشریشیا کلی را پیدا کرده‌اند كه می‌توانند در شرایط آزمایشگاهی به‌صورت دسته‌ای به سلول‌های HEP-2 متصل شوند. این سویه‌های انترواگریگیتیو می‌توانند از طریق پیلی‌های Bundle forming نیز به مخاط كلون متصل شده و به‌واسطه تولید انتروتوكسین مقاوم به حرارت با وزن مولکولی پایین كه با ST و LT متفاوت است، تولید اسهال عفونی آبكی بنمایند. بیشتر اسهال‌های ناشی از این سویه در جنوب شرقی آسیا روی می‌دهد.

و) سایر سویه‌های اشریشیاكلی:

باکتری‌های اشریشیا کلی غیرتوكسیژنیك، كه دارای پیلی‌های مقاوم به مانوز (CFA/II) هستند، به روده كوچك چسبیده و در بیمارانی كه سوءتغذیه دارند سبب اسهال‌های طولانی‌مدت می‌گردند. مكانیسم عمل این نوع اسهال ناشناخته است.

درمان و پیشگیری:

چنانكه در جدول 2 نشان داده شده از آنتی‌بیوتیک‌های مختلفی برای درمان عفونت‌های حاصل از اشریشیا کلی می‌توان استفاده كرد. انتخاب دقیق آنتی‌بیوتیک به نوع عفونت و حساسیت سویه اشریشیا کلی جداشده به آنتی‌بیوتیک‌ها بستگی دارد. در درمان اسهال، بدون توجه به سویه مولد، رهیدراتاسیون برای جبران آب و الکترولیت‌های ازدست‌رفته لازم است. سازمان بهداشت جهانی فرمول رهیدراتاسیون استانداردی ارائه داده كه می‌توان به‌صورت خوراكی مصرف كرد و محلول‌های خوراكی رهیدراتاسیون بسیاری نیز به‌صورت تجاری در دسترس است. از آنجایی که مواد بندآورنده مدفوع، مدت و خطر اسهال اشریشیا کلی را افزایش می‌دهند، بهتر است استفاده نشوند. شیوع عفونت‌های فرصت‌طلب ناشی از اشریشیا کلی، با رعایت ملاحظات ضدعفونی وسایل كلینیكی و با اجتناب از مصرف وسایل مهاجم مثل كاتترها قابل كاهش است.

مراقبت بهداشتی آب مصرفی، پخت كامل گوشت، تغذیه نوزاد با شیر مادر و پاستوریزاسیون شیر مقدار اسهال عفونی حاصل از اشریشیا کلی را كاهش می‌دهد. مسافران كشورهای توسعه‌یافته باید از خوردن هر چیزی كه كاملاً پخته نشده امتناع كنند و از نوشیدن مایعاتی كه جوشانده نشده‌اند یا به‌طور تجاری بسته‌بندی نشده‌اند، خودداری نمایند. پیشگیری دارویی عموماً برای مسافران توصیه نمی‌شود، اما استفاده از فلوروكینولون‌هایی نظیر سیپروفلوكساسین، نورفلوكساسین یا افلوكساسین برای افراد در معرض خطر تجویز می‌گردد.

تشخیص آزمایشگاهی

نمونه‌های ارسالی به آزمایشگاه شامل نمونه‌ی مدفوع، ادرار، خون، زخم، چرک، خلط، سنگ‌های کلیوی، CSF و مایع پلور می باشند. باید توجه داشت که جدا کردن اشریشیا کلی به تنهایی تشخیص را قطعی نمی‌کند و باید ثابت کرد که در نمونه، پاتوژن دیگری وجود ندارد. كشت مدفوع گران و مشكل است و نتایج آن سبب تغییر در روند درمان نمی‌گردد، به همین دلیل به‌صورت روتین نباید انجام گیرد. البته در موارد اسهال نامشخص و طولانی این آزمایش باید انجام گیرد. اگر به ‌ظاهر مدفوع توجه شود می‌توان محل، مكانیسم و نوع عفونت را حدس زد. مدفوع از لحاظ میكروسكپی از نظر PMN‌ها، اریتروسیت‌ها و انگل‌ها بررسی می‌گردد. نمونه مدفوع حتی‌الامكان باید هر چه زودتر كشت داده شود. اگر امکان کشت در عرض 4 ساعت بعد از جمع‌آوری مدفوع وجود ندارد، باید نمونه در یخچال قرار داده شود. بعد از كشت، سویه‌های خاص اشریشیا کلی را به راه‌های گوناگون می‌توان شناسایی كرد:

الف) ETEC را با جستجوی سموم LT و ST می‌توان شناسایی كرد. برای افتراق آن از سایر E.coli‌ها از PCR هم استفاده می‌کنند (ژن‌های ST ,LT را ردیابی می‌کنند).

ب) EPEC را با روش‌های سروتایپنیگ شناسایی می‌کنند.

ج) EAEC با پروب DNA شناسایی می‌شود.

د) EIEC را با استفاده از تست سرمی می‌توان تشخیص داد. در این آزمایش مایع حاوی باكتری به چشم خوكچه هندی تلقیح می‌گردد و اگر ایجاد كراتوكونژتكتیویت شد، نتیجه مثبت است. EIEC نیز مانند شیگلاها تست سرمی مثبت دارد. همانند شیگلا بدون حرکت است‌، لاکتوز را با تأخیر تخمیر می‌کند یا اصلاً تخمیر نمی‌کند و دارای پلاسمید تهاجمی است. برای افتراق از سایر سویه‌ها از تست سرمی استفاده می‌شود. سویه‌های EIEC را می‌توان با توانایی این باكتری برای تهاجم به رده سلولی هلا در شرایط آزمایشگاهی تشخیص داد. در ضمن اگر قطره‌ای از مدفوع بر روی لام با متیلن بلو رنگ‌آمیزی شود، می‌توان صفحاتی از PMN را مشاهده نمود.

ه) EHEC را با دو روش تشخیص می‌دهند؛ بیشتر سویه‌های اشریشیا کلی در هنگام رشد بر روی محیط كشت مكانکی حاوی سوربیتول، ‌سوربیتول را تخمیر می‌کنند، اما EHEC دارای این خاصیت نیست، بنابراین EHEC را می‌توان به‌صورت اشریشیا کلی سوربیتول منفی تشخیص داد و سپس آن را سروتایپ‌بندی كرد. این سویه از نظر تست MUG هم منفی است، علاوه‌بر این در آزمایشگاه مرجع با استفاده از آنتی‌سرم‌های اختصاصی روش‌های بیواسی با استفاده از سلول‌های Vero (کلیه میمون سبز آفریقایی) شناسایی می‌گردد.

در عفونت‌های خارج روده‌ای ابتدا نمونه روی محیط‌هایی مانند EMB، مکانکی آگار و SS آگار کشت داده شده و بعد از مشاهده باسیل‌های گرم منفی، کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی، تست‌های بیوشیمیایی از جمله IMViC (اندل، متیل‌رد، ووگس‌– پروسکوئر، سیمون سیترات)‌، TSI، تحرک در 37 درجه سانتیگراد و دمای اتاق (با محیط SIM)‌، تست اوره، لیزین دکربوکسیلاز، آرژینین دی‌هیدرولاز و تخمیر قندهایی مانند مانیتول، سوربیتول، آرابینوز، رامنوز و غیره انجام می‌شود.

به‌طورکلی باكتری اشریشیا كلی بر روی محیط‌های خیلی ساده به آهستگی رشد می‌کند، متحرك با فلاژل‌های پری‌تریش است،‌ کاتالاز مثبت، احیاکننده نیترات، بی‌هوازی اختیاری و غیر اسپوردار است. در جداسازی اولیه از نمونه‌های بالینی، تخمیر یا عدم تخمیر گلوکز توسط این باکتری‌ها اهمیت دارد و به همین علت به دو گروه لاکتوز مثبت (اغلب آنها لاکتوز مثبت هستند) و لاکتوز منفی تقسیم می‌شوند. اشریشیا کلی قادر است از استات به‌عنوان منبع کربن استفاده کند، اما قادر به استفاده از سیترات نیست، لذا از محیط سیمون سیترات برای شناسایی آن استفاده می‌شود. این باکتری گلوکز و سایر کربوهیدرات‌ها را تخمیر کرده و پیرووات تولید می‌کند، سپس آن را به اسیدهای لاکتیک، استیک و فرمیک تبدیل می‌کند. قسمتی از اسید فرمیک تولیدشده، طی سیستم پیچیده هیدروژن لیاز^[10] به مقادیر مسـاوی از CO2، H2 تبدیل می‌شود. اشریشیا کلی، ژلاتین را ذوب کرده و معمولاً آنزیم تریپتوفاناز داشته و به همین دلیل اندول تولید می‌کند. VP آن منفی و MR آن مثبت است که این آزمایش در تمایز این باکتری از انتروباکتر آئروژنز اهمیت فراوان دارد. همچنین این باکتری قادر به تجزیه اوره نیست. به‌طورکلی برای تمایز باکتری‌های روده‌ای از فرمول IMViC استفاده می‌شود که بدین ترتیب می‌توان این باکتری را از کلبسیلا، انتروباکترها و سایر کلی‌فرم‌های خاک و گیاهان متمایز نمود. سویه‌هایی که لاكتوز را تخمیر می‌کنند روی مکانکی به‌واسطه تخمیر، لاکتوز کلنی صورتی می‌دهند. بر روی ائوزین متیلن بلو ایجاد جلای فلزی سبزرنگ می‌کنند، همچنین دارای فعالیت دكربوكسیلاسیون لیزین بوده و تریپتوفان را هیدرولیز و ایجاد ایندول می‌نمایند. اوره‌آز منفی هستند و تولید H₂S نمی‌کنند و تست IMViC آن‌ها به‌صورت – – + + است. سویه‌های عامل عفونت ادراری روی BA، همولیز β دارند. باکتـــــری روی A/A :KIA،ء H₂S منفی و تولید گاز مثبت است. بیش از 90% از E.coli‌های جدا‌شده، تست بتاگلوکورونیدار (MUG) مثبت دارند.

در کشت ادرار باید ادرار استریل گرفته شود و هرچه زودتر باید کشت شود. ادرار در زنان معمولاً به‌وسیله سوند و در مردان از ادرار وسط تهیه می‌گردد. تعداد بالای صدهزار کلنی در روی محیط کشت نشان‌دهنده عفونت مجاری ادراری است و کمتر از این تعداد مشکوک باید در نظر گرفته شود.

به دلیل بروز مقاومت بالای دارویی در بین این باکتری‌ها، در مرحله نهایی باید الگوی حساسیت به آنتی‌بیوتیک‌ها مشخص شود. اشریشیا کلی و کلبیسلا پنومونیه تولید‌کننده بتالاکتاماز‌های وسیع‌الطیف (ESBL)، به سفوتاکسیم، سفتازیدیم و آزترونام مقاوم هستند، هرچند امروزه مطالعات نشان داده که این آنزیم‌ها در بیشتر انتروباکتریاسه‌ها و سودوموناس‌ها تولید می‌شوند. در جدول 4 واکنش‌های بیوشیمیایی كه در گونه‌های مختلف اشریشیا رخ می‌دهد، نشان داده شده است.

روش‌های بیوشیمیایی شناسایی انتروباکتریاسه‌ها (۴): شیگلا

اختلاف های بین باکتری های گرم مثبت و باکتری های گرم منفی

مروری بر روش‌های بیوشیمیایی برای شناسایی باکتری‌های گرم منفی

تست اکسیداز

واژه‌نامه: