کشت ارگانیسم‌ها به روش پورپلیت
روش پورپلیت (Pour Plate Method) یک تکنیک پرکاربرد در اغلب آزمایشگاه‌ها به ویژه آزمایشگاه‌های داروسازی، بالینی و صنایع غذایی است. این روش برای شمارش تعداد باکتری‌های خاص موجود در یک نمونه مورد استفاده قرار می‌گیرد. فرآیند انجام روش پورپلیت شامل مراحل روتین آزمایشگاهی (مانند ذوب کردن، حجم‌برداری و انکوباسیون) است که ممکن است ساده به نظر برسد اما بر اساس بررسی‌های انجام شده بسیاری از کاربران آزمایشگاهی برای انجام این روش دچار مشکلاتی هستند. به همین دلیل در این مطلب قصد داریم تا ضمن ارائه توضیحاتی در رابطه با روش پورپلیت و هدف انجام آن، فرایند کشت ارگانیسم‌ها به روش پورپلیت را نیز بیان کنیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.
مروری بر روش پورپلیت برای کشت ارگانیسم‌ها
روش پورپلیت که امروزه در آزمایشگاه‌های باکتریولوژی کاربرد گسترده‌ای دارد در ابتدا توسط فردی به نام رابرت کخ (Robert Koch) ابداع شد. در نمونه‌هایی که دارای جمعیت میکروبی و مخلوطی از انواع سلول‌ها هستند، می‌توان از روش پورپلیت برای تولید یک کشت خالص از میکروارگانیسم‌های موجود در این جمعیت میکروبی استفاده کرد. به طور کلی می‌توان گفت که هدف اصلی از انجام روش پورپلیت، جدا کردن یک کشت خالص از مخلوطی از جمعیت‌های میکروبیِ مختلف و نشان دادن مشخصات باکتری‌ها از جمله رنگ، بافت، اندازه، ارتفاع و غیره است.
این روش همچنین برای شمارش تعداد موجودات زنده در مایعات مانند آب، شیر، ادرار یا کشت آبگوشت و همچنین تعیین فعالیت همولیتیک کلنی‌های عمیق برخی از باکتری‌ها مانند استرپتوکوک‌ها با استفاده از یک محیط آگار حاوی خون کاربرد دارد.
پیش‌تر در مقاله ای با عنوان “اصول، روش و نتایج کشت خطی” در رابطه با تکنیک کشت خطی اطلاعاتی ارائه کردیم. تکنیک کشت خطی نیز برای ایجاد تک کلنی‌هایی از یک جمعیت میکروبی به کار می‌رود. شمارش باکتری‌ها به روش پور پلیت دقیق‌تر از روش کشت خطی است، اما به طور متوسط، میزان شمارش کمتری را ارائه می‌کند زیرا میکروارگانیسم‌های حساس به گرما در صورت تماس با محیط گرم و آگار مذاب ممکن است از بین بروند.
اهمیت روش پورپلیت
همانطور که گفته شد کشت ارگانیسم‌ها به روش پورپلیت جهت شمارش مناسب کلنی‌ها و انجام
آزمایشات بیشتر روی آن‌ها، مورد استفاده قرار می‌گیرد.
در این روش ، تعداد کل واحدهای تشکیل دهنده کلنی (CFU) در سطح یک محیط آگار محاسبه می‌شود. واحد تشکیل کلنی در حوزه میکروبیولوژی، واحدی است که برای تخمین تعداد سلول‌های باکتریایی زنده در یک نمونه محاسبه می‌شود. از نظر تئوری، یک سلول زنده قادر به رشد و تشکیل کلنی است و می‌توان گفت که هدف از شمارش کلنی‌ها با استفاده از روش پورپلیت، در واقع تخمین تعداد سلول‌ها بر اساس توانایی آن‌ها برای رشد و ایجاد کلنی تحت شرایط تغذیه ای، دمایی و زمانی خاص است.
CFU در میلی لیتر با استفاده از فرمول زیر محاسبه می‌شود:
*مقدار نمونه رقیق شده معمولا برابر با ۰/۱ یا ۱ میلی لیتر است
اصول روش پورپلیت
در این روش، ابتدا رقت‌های سریالی از نمونه آماده می‌شوند. سپس این رقت‌ها در پتری دیش‌هایی که حاوی آگار ذوب شده و خنك شده (۴۵-۴۲ درجه سانتیگراد) است تلقیح می‌شوند و با چرخش پتری دیش نمونه و آگار مخلوط خواهند شد. پس از جامد شدن آگار، پتری دیش‌ها درون انکوباتور قرار گرفته و در نهایت ظروف برای مشاهده‌ی کلنی‌های جداگانه بررسی خواهند شد. این کلنی‌های خالص که از نظر اندازه، شکل و رنگ متفاوت هستند ممکن است برای تهیه کشت‌های خالص به ظروف دیگری منتقل شوند.
در ادامه نحوه انجام روش پورپلیت را با جزئیات ذکر خواهیم کرد.
تجهیزات لازم برای کشت ارگانیسم‌ها به روش پورپلیت
- کشت مغذی از دو ارگانیسم متفاوت که ۲۴ ساعت از آماده سازی آن گذشته است.
- آگار مغذی
- شش لوله آزمایش حاوی ۹ میلی لیتر آب استریل
- پتری دیش استریل
- مارکر
- پیپت مدرج (۱ میلی لیتر)
مراحل انجام کشت به روش پورپلیت
۱. در اطراف پتری دیش استریل یا کف آن یک لیبل حاوی نام آزمونگر، تاریخ انجام آزمایش، نوع محیط کشت و نوع ارگانیسم‌هایی که باید به آگار ذوب شده اضافه کنید را بچسبانید. دقت داشته باشید که لیبل را نباید روی درب پتری دیش چسباند.
۲. برای کشت نمونه ممکن است نیاز به تهیه رقت‌های سریالی داشته باشید که منجر به کاهش سیستماتیک غلظت سلول‌ها در نمونه می‌شود. آماده سازی رقت‌های سریالی در صورتی ضروری است که تعداد سلول‌های نمونه بیش از ظرفیت پتری دیش حاوی آگار باشد. این ظرفیت معمولا با واحد CFU سنجیده شده و عددی بین ۳۰ تا ۳۰۰ CFU است. اگر تعداد سلول‌های نمونه بیش از ۳۰۰ CFU تخمین زده شود، کلنی‌ها با هم تداخل خواهند داشت.
۳. یک لوله حاوی ۱۸ میلی لیتر آگار ذوب شده تهیه کنید.
۴. آگار باید از قبل در اتوکلاو استریل شده باشد و سپس در لوله‌های آزمایشگاهی توزیع شود.
۵. دقت داشته باشید که آگار را در همان زمانی آماده کنید که قصد انجام آزمایش را دارید. آگار را باید به مدت ۳۰ دقیقه در اتوکلاو قرار دهید تا استریل شود و سپس آن‌را به حمام آب ۵۵ درجه سانتیگراد منتقل کنید. آگار ذوب شده دیگر قابل استفاده نیست بنابراین آن‌را به مقداری که نیاز دارید تهیه کنید.
۶. ده دقیقه قبل از ریختن آگار در پتری دیش، آگار ذوب شده باید از حمام آب ۵۵ درجه سانتیگراد بیرون آورده شود تا به دمای ۴۸ درجه سانتیگراد قرار برسد. وقتی آگار به این دما رسید، آماده ریختن است. اگر آگار بیش از حد گرم باشد ممکن است باکتری‌های موجود در نمونه از بین بروند. از طرف دیگر اگر آگار بیش از حد خنک باشد، ممکن است حین جامد شدن گلوله گلوله شود.
۷. لوله حاوی نمونه مورد نظر خود را بردارید. نمونه باید به صورت یک کشت آبگوشت یا یک سوسپانسیون سلولی باشد که با مخلوط کردن سلول‌ها در بافر یا سالین تولید می‌شود. در صورت نیاز از رقت‌های سریالی استفاده کنید.
۸. درب پتری دیش را باز کنید و نمونه خود را به کمک پیپت سرولوژی یا سمپلر وسط ظرف پخش کنید. درب را ببندید. جریان نمونه را کنترل کنید تا از پتری دیش بیرون ریخته نشود.
۹. دقت داشته باشید که حین انجام آزمایش باید از تکنیک‌های آسپتیک استفاده کنید.
۱۰. درپوش لوله حاوی آگار ذوب شده را برداشته و لبه لوله را با استفاده از چراغ بونزن حرارت دهید.
۱۱. درب ظرف حاوی نمونه را باز کرده و آگار را با دقت در آن بریزید. درب ظرف را ببندید و با چرخاندن آرام پتری دیش، نمونه را با آگار مخلوط کنید.
۱۲. اجازه دهید آگار کاملا جامد شود.
۱۳. سپس پتری دیش را به صورت وارونه درون انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار دهید.
بررسی نتایج
برای مشاهده نتایج کشت ارگانیسم‌ها به روش پورپلیت، بعد از ۲۴-۴۸ ساعت انکوباسیون، تمام پتری‌دیش‌های انکوباسیون شده را جهت یافتن کلنی‌های مجزا روی آگار بررسی کنید. توجه داشته باشید که در روش پورپلیت کلنی‌ها هم در عمق آگار و هم در سطح آن تشکیل می‌شوند. در نتیجه، کلنی‌ها معمولاً از اندازه‌های مختلفی برخوردار هستند زیرا اکسیژن موجود در عمق آگار کمتر از سطح آن است و از آنجایی که اکثر ارگانیسم‌ها هوازی سخت یا بی‌هوازی هستند، در بیشترین غلظت اکسیژن رشد خواهند کرد. کلنی‌های مشاهده شده را می‌توان برای انجام آزمایش‌های بیشتر به محیط کشت دیگری منتقل کرد.
۷ نکته مهم برای انجام روش پورپلیت
همانطور که در ابتدای این مطلب گفته شد، در روش پورپلیت از تکنیک‌های روتین آزمایشگاهی مانند انکوباسیون و حجم‌برداری استفاده می‌شود. با این وجود بسیاری از کاربران آزمایشگاهی در انجام آن با چالش‌هایی مواجه هستند. تا به اینجای مطلب در رابطه با روش کشت ارگانیسم‌ها به روش پورپلیت اطلاعاتی ارائه کرده‌ایم. در انتهای این مطلب قصد داریم ۷ نکته‌ای را بیان کنیم که می‌توانند به شما در انجام یک پورپلیت صحیح کمک کنند. بار دیگر که از روش پور پلیت برای شمارش میکروبی استفاده کردید، از این ۷ نکته غافل نشوید.
۱. آگار مذاب را بیش از سه تا چهار ساعت در حمام آب قرار ندهید. آگار را تا زمانی که دمای آن به کمتر از ۵۰ درجه سانتی گراد نرسیده است (ترجیحاً ۴۴ تا ۴۶ درجه سانتیگراد) به نمونه اضافه نکنید.
۲. آگار را چندبار ذوب نکنید. آگار فقط باید یکبار ذوب شود.
۳. در صورت لزوم از بافر فسفات با pH 7.2 استفاده کنید تا سوسپانسیون رقیق شود.
۴. ریختن آگار و نمونه در پتری دیش را زیر هود ایمنی بیولوژیکی انجام دهید تا خطر آلودگی کاهش یابد. همچنین قبل از انتقال آگار به ظروف بعدی، دهانه فلاسک یا لوله‌ی حاوی آگار را حرارت دهید تا خطر آلودگی کاهش یابد.
۵. پتری دیش‌ها را مطابق با توصیه‌های صورت گرفته توسط سازمان‌های معتبر و یا قوانین آزمایشگاه خود پر کنید. به طور مثال سازمان غذا و دارو آمریکا (FDA) توصیه می‌کند که پتری دیش با 12 الی 15 میلی لیتر آگار پر شود. درحالیکه سازمان داروسازی ایالات متحده (USP) افزودن 15 الی 20 میلی لیتر آگار را توصیه می‌کند.
۶. اغلب گونه‌های باکتریایی معمولا نیاز به ۴۸ الی ۷۲ ساعت انکوباسیون دارند. اما ممکن است گونه‌های کاندیدا آلبیکانس و Aspergillus brasiliensis سه تا پنج روز نیاز به انکوباسیون داشته باشند.
۷. کلنی‌های کوچک میکروارگانیسم ها مانند سودوموناس آئروژینوزا را با کمک کلنی کانترها بشمارید.
