رنگ آمیزی به روش گوموری متنامین سیلور (GMS)
در آزمایشگاه‌های پاتولوژی، تکنیک رنگآمیزی گوموری متنامین سیلور (Gömöri methenamine silver)، که با نام اختصاری GMS نیز شناخته می‌شود، یک روش رنگآمیزی محبوب است. این تکنیک رنگآمیزی در اصل از نام یک پزشک مجارستانی به نام György Gömöri گرفته شده است.
تکنیک رنگآمیزی گوموری متنامین سیلور به‌طور گسترده‌ای برای نمایش قارچ‌ها کاربرد دارد و در رنگآمیزی کربوهیدرات‌ها نیز مفید است. به‌طور مثال از این تکنیک می‌توان برای شناسایی قارچ پنوموسیستیس جیرووسی (Pneumocystis jiroveci) استفاده کرد. پنوموسیستیس جیرووسی نوعی قارچِ شبیه مخمر است که باعث بروز نوعی پنومونی به نام پنوموسیستیس پنومونی [۱] (PCP) یا پنوموسیستوز [۲] می‌شود. با استفاده از تکنیک رنگآمیزی گوموری متنامین سیلور دیواره‌های سلولی این موجودات به رنگ قهوه‌ای مایل به سیاه مشخص می‌شود.
در این مقاله قصد داریم شما را با مواد و محلول‌های مورد استفاده در تکنیک رنگآمیزی گوموری متنامین سیلور آشنا کرده و روش این رنگآمیزی و نتایج حاصل از آن را بیان کنیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.
رنگآمیزی به روش گوموری متنامین سیلور اصلاح شده [۳]
- هدف: شناسایی قارچ‌ها.
- اصول: اجزای موکوپلی ساکارید [۴] دیواره‌ی سلولی قارچ برای آزاد سازی گروه‌های آلدهید اکسید می‌شوند. این گروه‌های آلدهیدی با نیترات نقره واکنش نشان می‌دهند و آن‌ها را قابل مشاهده می‌سازند.
- بافت: هر نوع بافت حاوی قارچ. بلوک بافت حاوی آسپرژیلوز (aspergillosis) و پنوموسیستیس (pneumocystis) ارجحیت دارد.
- فیکساتیو: فرمالین ۱۰%
- تکنیک: برش بلوک پارافین ۴ تا ۵ میکرومتر
- تجهیزات: ظروف شیشه‌ای شسته شده با اسید، جار رنگآمیزی، بن‌ماری.
۱. مواد و ریجنت‌ها
۱-۱. کرومیک اسید ۵%:
- کروم تری اکسید———– ۵/۰ گرم
- آب مقطر—————– ۱۰۰/۰ میلی لیتر
دو ماده را مخلوط کنید. این محلول به مدت ۶ ماه پایدار است.
توجه: اسید کرومیک خورنده است و برای پوست و غشاهای مخاطی بسیار سمی است. این ماده بر اندام‌های بدن از جمله کلیه‌ها تاثیرات مخربی گذاشته و سرطان‌زا نیز هست. بنابراین حین کار با آن احتیاط کنید و از تماس و استنشاق آن اجتناب نمایید.
۲-۱.سدیم متابی سولفیت % ۱:
- سدیم متابیسولفیت———– ۵/۰ گرم
- آب مقطر——————- ۵۰۰/۰ میلی لیتر
دو ماده را مخلوط کنید. این محلول به مدت ۶ ماه پایدار است.
توجه: سدیم متابیسولفیت سمی است و می‌تواند باعث مشکلات دستگاه گوارش شود. این ماده تحریک کننده پوست، چشم و غشای مخاطی نیز می‌باشد.
۳-۱. بوره ( بوراکس) %۵:
- سدیم بورات———– ۵/۰ گرم
- آب مقطر————–۱۰۰/۰ میلی لیتر
دو ماده را مخلوط کنید. این محلول به مدت ۳ ماه پایدار است.
۴-۱. استوک متنامین سیلور:
- متنامین (هگزامتیلن تترامین) % ۳ ———–۱۰۰/۰ میلی لیتر
- نیترات نقره %۵ ————————– ۵/۰ گرم
دو ماده را با یکدیگر مخلوط کنید و داخل یک بطری قهوه‌ای رنگِ تمیز شده با اسید بریزید. استوک را در یخچال نگهداری کنید. این استوک به مدت ۳ ماه پایدار است.
توجه: نیترات نقره تحریک کننده شدید پوست و چشم است و می‌تواند مشکلاتی جدی برای دستگاه گوارش را به دنبال داشته و سبب اختلال در بلع شود. احتمال ابتلا به سرطان نیز در اثر تماس یا استنشاق این ماده وجود دارد.
۵-۱. کلرید طلا % ۰/۵:
- کلرید طلا———– ۰/۵ گرم
- آب مقطر———– ۱۰۰/۰ میلی لیتر
دو ماده را باهم مخلوط کنید و درون بطری پاک شده با اسید بریزید. محلول را درون یخچال قرار دهید. این محلول به مدت ۱ سال پایدار است.
احتیاط: از تماس و استنشاق خودداری کنید.
۶-۱. سبز روشن % ۰/۲:
- سبز روشن SF مایل به زرد [۵] ———– ۰/۲ گرم
- آب مقطر———————— ۱۰۰/۰ میلی لیتر
- اسید استیک گلاسیال———– ۰/۲ میلی لیتر
مواد را با یکدیگر مخلوط کنید. این محلول به مدت ۶ ماه پایدار است. این ماده سرطان‌زا است. بنابراین از تماس و استنشاق آن خودداری نمایید.
توجه: حین رنگآمیزی و یا آماده‌سازی محلول‌ها حتما از دستکش، عینک و روپوش آزمایشگاهی استفاده کنید. محلول‌های داغ و بدون درب را زیر هود آزمایشگاهی قرار دهید و از تماس و استنشاق رنگ‌ها و مواد شیمیایی خودداری کنید.
۲. مراحل رنگآمیزی به روش گوموری متنامین سیلور
۱. مراحل پارافین زدایی و هیدراسیون با آب مقطر را انجام دهید.
۲. اسید کرومیک ۵٪ را به مدت ۱ ساعت درون بن‌ماری و در دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد قرار دهید. لام را درون اسید کرومیک قرار داده و اجازه دهید به مدت ۵ دقیقه درون آن باقی بماند.
۳. لام را ابتدا با آب شیر شسته و سپس با آب مقطر آبکشی کنید.
۴. سپس لام را به مدت ۱ دقیقه درون سدیم متابی سولفیت % ۱ که به دمای اتاق رسیده است قرار دهید.
۵. لام را شسته و سپس ۳ مرتبه با آب مقطر، آبکشی نمایید.
۶. محلول متنامین سیلور را به مدت ۱ ساعت درون بن‌ماری و در دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد قرار دهید. لام را درون محلول قرار دهید. توجه داشته باشید که لام باید تا زمانی در محلول باقی بماند که بافت قهوه‌ای تیره شود. برای بهبود کیفیت رنگآمیزی می‌توانید لام را درون محلول تکان دهید.
۷. لام را ۲ مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.
۸. سپس لام را درون کلرید طلا % ۰/۵ قرار دهید و اجازه دهید ۱ دقیقه در محلول باقی بماند. اگر رنگ بافت خاکستری نشد، لام را کمی دیگر درون محلول قرار دهید تا رنگ بافت خاکستری شود. سپس لام را با استفاده از آب مقطر بشویید.
۹. لام را درون سدیم تیوسولفات ۵% (Hypo) قرار دهید. پس از ۳ دقیقه ابتدا لام را با آب شسته و سپس با آب مقطر آبکشی نمایید.
۱۰. لام را درون محلول سبز روشن قرار دهید. بعد از ۱ دقیقه لام را با آب مقطر آبکشی کنید.
۱۱. در انتها مراحل دهیدراسیون، شفاف‌سازی و قرار دادن لامل روی لام را انجام دهید.
۳. نتایج
- قارچ————– سیاه
- زمینه————- سبز
توجه: برای بهتر بودن نتایج، نکات زیر را در نظر داشته باشید:
- اگر اسید کرومیک به رنگ قهوه‌ای درآمد، باید محلول را تعویض کنید.
- اگر محلول نقره‌ای که درون ظرف نگهداری می‌کنید در کنار های ظرف شیشه‌ای کدر شد یا به صورت آینه‌ای درآمد، یک محلول جدید تهیه کنید.
- اگر ارگانیسم‌ها رنگ (سیاه) نمی‌گیرند، از اسیدکرومیک،سدیم متابیسولفیت و بوراکس تازه تهیه شده استفاده کنید.
| Modified Grocott’s Methenamine Silver Stain | [۳] | Pneumocystosis | [۲] |
Pneumocystis pneumonia |
[۱] |
| Light green SF yellow | [۵] | Mucopolysaccharide | [۴] |
