آزمایش تخمیر کربوهیدرات: اصول، روش و نتایج

باکتری‌ها، میکروارگانیسم‌هایی هستند که گونه‌های بسیار متعددی دارند و با پیشرفت علم و تکنولوژی، محققین همواره در حال یافتن گونه‌های جدیدی از باکتری‌ها هستند. با توجه به این گستردگی و تنوع، لازم است محققان آزمایش‌های متعددی را برای تمایز و شناسایی گونه‌های باکتریایی انجام دهند. برخی از این آزمایشات مربوط به رنگ آمیزی است و برخی دیگر نیز آزمایشات بیوشیمیایی هستند.

آزمایش تخمیر کربوهیدرات (carbohydrate-fermentation-test) یکی از این آزمایشات بیوشیمیایی است. الگوهای تخمیر کربوهیدرات در تمایز بین گروه‌ها یا گونه‌های باکتری بسیار مفید و حائز اهمیت است. در ادامه‌ی این مطلب قصد داریم به بررسی آزمایش تخمیر کربوهیدرات، دلیل انجام این آزمایش و نتایج حاصل از آن بپردازیم.

اصول و مبنای آزمایش تخمیر کربوهیدرات

کربوهیدرات‌ها مولکول‌های آلی هستند که از کربن، هیدروژن و اکسیژن (CH₂O)_n تشکیل شده‌اند. بر اساس ساختار و تعداد اتم‌های کربن موجود، سه نوع کربوهیدرات وجود دارد:

• مونوساکاریدها (شکر ساده حاوی 3 الی7 اتم کربن)
• دی ساکاریدها (شامل دو مونوساکارید که توسط پیوند گلیکوزیدی به‌هم متصل شده‌اند)
• پلی‌ساکاریدها (شامل حداقل 8 مولکول مونوساکارید).

تعداد زیادی از باکتری‌ها، قدرت تجزیه شیمیایی کربوهیدرات‌ها را دارند. اما تجزیه کربوهیدرات بسته به سیستم آنزیمی ارگانیسم متفاوت است. به همین دلیل، آزمایش تخمیر کربوهیدرات به عنوان روشی برای تمایز بیوشیمیایی میکروارگانیسم‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.

آزمایش تخمیر کربوهیدرات، به بررسی وجود اسید یا گاز تولید شده از تخمیر کربوهیدرات در یک محیط کشت می‌پردازد. اصطلاح تخمیر (fermentation) اغلب برای توصیف تجزیه یا کاتابولیسم (catabolism) یک کربوهیدرات در شرایط بی‌هوازی استفاده می‌شود. بنابراین، باکتری‌هایی که قادر به تخمیر کربوهیدرات هستند، معمولاً بی‌هوازی اختیاری می‌باشند.

برای انجام آزمایش تخمیر کربوهیدرات، از محیط پایه حاوی یک منبع کربوهیدراتی مانند گلوکز، لاکتوز، ساکارز یا هر کربوهیدرات دیگری استفاده می‌شود. در صورتی که میکروارگانیسم مورد بررسی، قادر به تخمیر کربوهیدرات باشد، نوعی اسید ( برخی مواقع اسید به همراه نوعی گاز) تولید می شود.

 بسته به ارگانیسم‌های درگیر و محیط تخمیر شده، نوع اسید ممکن است متفاوت باشد. به طور مثال در نتیجه‌ی تخمیر کربوهیدرات  توسط باکتری ممکن است اسید لاکتیک، اسید فرمیک، اسید استیک، اسید بوتیریک، بوتیل الکل، استون، اتیل الکل، دی اکسید کربن و هیدروژن در محیط کشت تولید شوند.

تولید اسید باعث کاهش pH محیط آزمایش می‌شود. به همین دلیل محیط کشت‌هایی که برای انجام آزمایش تخمیر کربوهیدرات مورد استفاده قرار می‌گیرند، حاوی یک نشانگر pH هستند.

 این نشانگرهای pH  معمولا محلول آندراد^[1]، بنفش برموکرزول (BCP)^[2]، آبی برموتیمول (BTB) ^[3] یا فنل رد^[4] هستند که دراین بین فنل، پرکاربردتر است.

جدول 1، نتایج استفاده از نشانگرهای مختلف در آزمایش تخمیر کربوهیدرات را نشان می‌دهد.

جدول 1. نشانگرهای مختلف در آزمایش تخمیر کربوهیدرات

لوله دورهام برای بررسی تولید گاز توسط میکروارگانیسم‌ها استفاده می‌شود. لوله‌های دورهام از لوله آزمایش‌های ساده، کوچکتر هستند و به صورت وارونه در لوله آزمایش حاوی محیط کشت قرار داده می‌شوند.

این لوله کوچک، ابتدا با محلولی که میکروارگانیسم در آن رشد می‌کند پر می‌شود. اگر میکروارگانیسم قادر به تولید گاز باشد، پس از تلقیح و انکوباسیون، یک حباب گاز داخل لوله دورهام قابل مشاهده خواهد بود.  (شکل 2- ج)

پس از انجام آزمایش تخمیر کربوهیدرات و بر اساس ویژگی‌های مشاهده شده در واکنش، می‌توان باکتری‌ها را به صورت زیر طبقه‌بندی کرد:

• غیر تخمیر کننده (شکل 2-الف)
• تخمیر کننده کربوهیدرات فقط با تولید اسید (شکل 2-ب)
• تخمیر کننده کربوهیدرات با تولید اسید و گاز (شکل 2-ج)

روش انجام تست تخمیر کربوهیدرات

همانطور که در قسمت قبل نیز گفته شد، آبگوشت کربوهیدرات حاوی فنل رد (فنل قرمز) معمولاً در آزمایشات تخمیر کربوهیدرات استفاده می‌شود و منابع کربوهیدرات ممکن است بر اساس نیازهای آزمایش متفاوت باشند ( به عنوان مثال: آبگوشت گلوکز فنل رد، آبگوشت لاکتوز فنل رد، آبگوشت مالتوز فنل رد، آبگوشت مانیتول فنل رد و آبگوشت ساکارز فنل رد)

۱. آماده سازی محیط کشت

محیط کشت حاوی کربوهیدرات فنل رد را می‌توان به صورت تجاری و از طریق تامین‌کنندگان مواد آزمایشگاهی خریداری نمود. با این وجود، شما می‌توانید این محیط کشت را در آزمایشگاه بر اساس نیاز خود آماده کنید.  به این منظور دستورالعمل زیر را دنبال کنید:

• تریپتیکاز یا پروتئاز پپتون ^[5]: 10 گرم
• سدیم کلرید (NaCl): 5 گرم
• عصاره گوشت گاو (اختیاری): 1 گرم
• فنل قرمز (حاوی2/7 میلی لیتر محلول فنل قرمز 25/0٪): 018/0 گرم
• منبع کربوهیدرات: 10 گرم

جهت تهیه آبگوشت، مواد فوق را در 1000 میلی لیتر آب مقطر یا دیونیزه بریزد.  این ترکیب را روی هیتر استیرر قرار داده و با سرعت کم مخلوط کنید.

توجه: منبع کربوهیدرات را بر اساس نیاز خود و پروتکل‌های آزمایشگاه انتخاب کنید.

4 الی 5 میلی لیتر از آبگوشت را داخل لوله آزمایش‌های 100×13 بریزید و یک لوله دورهام را به صورت وارونه درون آن قرار دهید.

محیط کشت آماده شده را اتوکلاو کنید تا استریل شود. (در دمای 121 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه). توجه داشته باشید که این فرایند اتوکلاو کردن، سبب می‌شود تا آبگوشت به داخل لوله دورهام نفوذ کند. آبگوشت تهیه شده باید به رنگ قرمز روشن باشد.

pH نهایی محیط کشت 2/0 ± 4/7 است.

توجه: هنگام استفاده از آرابینوز، لاکتوز، مالتوز، سالیسین، ساکارز، ترهالوز یا زایلوز، آبگوشت را در دمای 121 درجه سانتی‌گراد فقط به مدت 3 دقیقه اتوکلاو کنید، زیرا این کربوهیدرات‌ها ممکن است در دمای بالا در معرض تجزیه قرار گیرند. انکوباسیون بیش از حد ممکن است پروتئین‌ها را تجزیه کند و نتایج مثبت کاذب را به دنبال خواهد داشت.

۲. تلقیح و انکوباسیون

با استفاده از لوپ استریل شده، هر لوله آزمایش را با میکروارگانیسم مورد نظر به صورت آسپتیک تلقیح کنید. لوله‌ها را در دمای 35 الی37 درجه سانتی‌گراد به مدت 18 تا24 ساعت انکوباسیون کنید. دقت داشته باشید که ممکن است برای تایید نتیجه به دوره‌های انکوباسیون طولانی‌تری نیاز باشد.

۳. تفسیر نتایج

الف/ تولید اسید:

1. مثبت: اگر ارگانیسم مورد آزمایش تخمیر کننده کربوهیدرات باشد، پس از انکوباسیون مایع داخل لوله زرد می‌شود. این موضوع نشان می‌دهد که pH  محیط کشت به دلیل تولید اسید در اثر تخمیر کربوهیدرات (قند) موجود در محیط کاهش یافته است.

توجه: اگر از سایر نشانگرهای pH استفاده می‌کنید، لطفاً به جدول 1 برای رنگ‌های مربوط به آن‌ها در pH خاص مراجعه کنید.

2. منفی: اگر ارگانیسم مورد آزمایش تخمیر کننده کربوهیدرات نباشد، لوله حاوی محیط کشت قرمز باقی می‌ماند. به این معنا که باکتری مورد آزمایش، نمی تواند منبع کربوهیدرات خاصی را که در محیط کشت وجود دارد تخمیر کند.

ب/ تولید گاز

1. مثبت: اگر باکتری مورد نظر قادر به تولید گاز باشد، یک حباب (کوچک یا بزرگ بسته به مقدار گاز تولید شده) در لوله دورهام دیده می‌شود.
2. منفی: : اگر باکتری مورد نظر قادر به تولید گاز نباشد، هیچ حبابی در لوله دورهام معکوس وجود نخواهد داشت. این امر به این معنا است که باکتری با تخمیر کربوهیدرات خاص موجود در محیط، گاز تولید نمی‌کند. یعنی میکروارگانیسم مورد نظر، بی هوازی است.

مروری بر نتایج آزمایش تخمیر کربوهیدرات

پس از آشنایی با اصول انجام آزمایش تخمیر کربوهیدرات، اجازه دهید مروری بر نتایج آزمایش حاصل از این آزمایش برای گونه‌های مختلف باکتریایی داشته باشیم.

همانطور که گفته شد، الگوهای تخمیر کربوهیدرات را می‌توان برای تمایز بین گروه‌ها یا گونه‌های باکتری استفاده کرد. به عنوان مثال:

1. همه اعضای خانواده انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae) تخمیرکننده گلوکز هستند. این گونه‌های باکتریایی می‌توانند گلوکز را به صورت بی‌هوازی متابولیزه کنند.
2. به کمک آزمایش تخمیر کربوهیدرات، می‌توان پروتئوس ولگاریس (Proteus vulgaris) که مالتوز مثبت است را از پروتئوس میرابیلیس (Proteus mirabilis) که مالتوز منفی است، تمایز داد.
3. نایسریا گونوره ^[6] (گونوکوک) و نایسریا مننژیتیدیس ^[7] (مننگوکوک) هر دو توانایی تخمیر گلوکز را دارند، اما فقط مننگوکوک‌ها قادر به تخمیر مالتوز هستند و این راهی مفید برای تمایز این دو است

جمع‌بندی

بررسی توانایی باکتری‌ها در تخمیر کربوهیدرات‌های خاص، روشی پرکاربرد برای شناسایی میکروارگانیسم‌ها است. این روش به ویژه برای بررسی باسیل‌های روده‌ای و انتروکوک‌ها توصیه می‌شود. در این مقاله سعی کردیم به معرفی اصول و روش انجام آزمایش‌ تخمیر کربوهیدرات بپردازیم و مروری بر نتایج حاصل از آن داشته باشیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.

واژه نامه: