روش رنگ‌آمیزی آلسین‌بلو (pH=2.5) با استفاده از مایکروویو
آلسین بلو (Alcian blue) یکی از روش‌های رنگ‌آمیزی بافت است. در آزمایشگاه‌های هیستولوژی برای نمایش دادن موسین‌های اسیدی از این روش رنگ‌آمیزی استفاده می‌کنند.
رنگ‌آمیزی آلسین بلو بیش‌تر برای تشخیص آسیب‌های پاتولوژیکی در نمونه‌های بافتی دستگاه گوارش (GI) استفاده می‌شود. مواد مخاطی اسیدی پس از رنگ‌آمیزی با آلسین‌بلو به رنگ آبی فیروزه‌ای مشاهده می‌شوند.
همچنین استفاده از محلول‌های آلسین بلو با pH های مختلف می‌تواند به تمایز میان انواع مخاط اسیدی کمک کند.
آلسین‌بلو بعد از ترکیب با رنگ‌های دیگر کارایی بیش‌تری خواهد داشت. به عنوان مثال در ترکیب با روش‌هایی مانند PAS و کریبرگ بهتر عمل می‌کند و گستره‌ی رنگ‌آمیزی آن بیش‌تر می‌شود.
آلسین بلو در صورت ترکیب با رنگ PAS می‌تواند هر دو موسین اسیدی و خنثی را در یک نمونه بافتی نشان دهد. آلسین بلو باعث آبی شدن موسین‌های اسیدی می‌شود و PAS موسین‌های خنثی را به رنگ قرمز در می‌آورد.
در ادامه به معرفی روش رنگ‌آمیزی آلسین‌بلو (pH=2.5) با استفاده از مایکروویو می‌پردازیم.
مواد مورد نیاز
فیکساتیو: بافر فرمالین %۱۰
برش‌های پارافینی ۵ میکرومتری
محلول‌های مورد نیاز
1- محلول استیک‌اسید %۳
| مواد مورد نیاز | مقدار مورد نیاز |
| استیک‌اسید گلایسیال | ۳ میلی‌لیتر |
| آب مقطر | ۹۷ میلی‌لیتر |
2- محلول آلسین‌بلو %۱
| مواد مورد نیاز | مقدار مورد نیاز |
| رنگ آلسین‌بلو ۸GX, C.I. 74240 | ۱ میلی‌لیتر |
| استیک‌اسید %۳ | ۱۰۰ میلی‌لیتر |
محلول به‌دست آمده را فیلتر کنید و چند کریستال تیمول به آن اضافه کنید.
3- محلول نوکلئار فست رد
| مواد مورد نیاز | مقدار مورد نیاز |
| نوکلئار فست رد | ۱ گرم |
| محلول آلومینیوم‌سولفات %۵ | ۱۰۰ میلی‌لیتر |
نوکلئار فست رد را به کمک گرما در محلول آلومینیوم‌سولفات %۵ حل کنید.
سپس محلول را خنک کرده و آن را فیلتر کنید تا صاف شود. در آخر چند دانه تیمول را به عنوان نگهدارنده به آن اضافه کنید.
مراحل رنگ‌آمیزی
۱) بافت را دپارافینه کنید سپس هیدراسیون با آب مقطر را انجام دهید.
۲) لام را به مدت ۳ دقیقه در استیک‌اسید %۳ قرار دهید.
۳) لام را در جار رنگ‌آمیزی که با ۴۰ میلی‌لیتر محلول آلسین‌بلو %۱ پر شده است قرار داده و آن را به مدت ۳ دقیقه داخل مایکروویو سطح ۱ (با قدرت W60) قرار دهید. بعد از گذشت این زمان جار را از مایکروویو بیرون بیاورید. سپس لام را چند مرتبه بالا و پایین کنید و اجازه دهید تا ۵ دقیقه داخل محلول داغ (۶۵ درجه سانتی‌گراد) باقی بماند.
* هنگام حرارت دادن محلول آلسین‌بلو به وسیله مایکروویو، قسمت بالای محلول ۱۰ تا ۱۵ درجه سانتی‌گراد گرم‌تر از قسمت پایینی آن است. بنابراین برای یکسان‌سازی دمای محلول، لام را در آن بالا و پایین می‌برند. این کار باعث می‌شود قسمت‌های مختلف بافت به طور یکنواخت رنگ‌آمیزی شوند.
۴) در این مرحله لام را به مدت ۱ دقیقه با آب شیر بشویید سپس آن را با آب مقطر آبکشی کنید.
۵) لام را به مدت ۳ دقیقه در محلول نوکلئار فست رد قرار دهید.
۶) در مرحله بعد لام را سه مرتبه در آب مقطر بشویید.
۷) حالا با کمک الکل‌هایی با درجه‌بندی‌های متفاوت، دهیدراسیون لام را انجام دهید.
۸) لام را سه یا چهار مرتبه با زایلن تمیز کنید.
۹) در مرحله آخر جهت از بین بردن حباب‌ها و بررسی راحت تر لام زیر میکروسکوپ آن را با رزین بپوشانید.
نتیجه رنگ‌آمیزی آلسین‌بلو
| ترکیبات موکوسی (مخاطی) اسیدی سولفاته | آبی |
| قارچ کریپتوکوکوس (Cryptococcus) | آبی |
| هسته‌ها | قرمز |
توضیحات تکمیلی
- هیچ محلول رنگ‌آمیزی آلسین‌بلویی به تنهایی نمی‌تواند همه‌ی پلی‌آنیون‌ها را رنگ‌آمیزی کند اما روش فوق که در pH=2.5 انجام شده است، همه‌ی پلی‌آنیون‌ها به جز موکوپلی‌ساکاریدهای سولفاته قوی را رنگ‌آمیزی می‌کند.
این روش برای نمایش دادن سلول‌های مخاطی موجود در دستگاه تنفس، روده کوچک و روده بزرگ و همچنین اجزای مختلف تشکیل‌دهنده پوست، دریچه‌های قلب، عروق بزرگ و غضروف‌ها بسیار مفید است.
- ممکن است بتوانید رنگ‌آمیزی با محلول آلسین‌بلو را در دمای اتاق و بدون استفاده از مایکروویو و تجهیزات گرمایی دیگر انجام دهید اما احتمالا پروسه رنگ‌آمیزی در مدت زمان طولانی‌تری (حدود ۳۰ دقیقه) انجام خواهد شد.
چند نمونه از نتایج به دست آمده از رنگ آمیزی آلسین بلو:
