اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی – آزمایش مستقیم و کشت (بخش چهارم)
تهیه و تنظیم: دکتر محمد قهری
۸- آماده‌سازی نمونه
روش آماده‌سازی نمونه بر حسب نوع و مقدار نمونه متفاوت است. دستورالعمل مربوط به نمونه‌های اختصاصی در ضمیمه‌ی A آورده شده است.
۸-۱- تغلیظ
حداقل به میزان ۲ میلی‌لیتر از نمونه را برداشته و به‌مدت ۱۰ دقیقه با سرعت ۱۵۰۰ الی gء۲۰۰۰ سانتریفیوژ نمائید. مایع رویی را در صورت نیاز برای انجام تست‌های دیگر آسپیره كرده و نگهداری كنید. رسوب را در مقدار كمی از مایع باقیمانده مجددا به حالت تعلیق درآورید. برای انواع نمونه‌هایی كه نیاز به تكنیک تغلیظ دارند به ضمیمه A رجوع فرمائید.
۸-۲- تلقیح مستقیم
اكثر نمونه‌ها را می‌توان بطور مستقیم به داخل محیط كشت تلقیح نمود. عموما یک تلقیح سنگین (بعنوان مثال ۰/۲۵ الی ۰/۵ میلی‌لیتر در هر بلیت) برای كشت و جداسازی قارچ‌ها مورد نیاز است.
۸-۳- خورد كردن و هموژنیزه كردن
بریدن یا خرد كردن نمونه‌ی بافت، قطعه‌ی ناخن، و یا تكه‌های لخته موجب می‌شود كه امكان مواجهه‌ی میكروارگانیسم‌های موجود در نمونه به سطح محیط كشت افزایش یابد. برای انجام این كار نمونه را در یك پتری دیش استریل قرار داده و چند قطره آب خالص استریل یا سالین استریل به آن اضافه كرده و سپس بوسیله‌ی اسكالپل آن را خورد كنید و بعد چند قطعه‌ی خرد شده را در محیط كشت تلقیح نمائید. علاوه‌بر قطعات خورد و ریز شده با كمك دستگاه خورد كن استریل (tissue grinder)، قطعات بزرگتر بافتی را نیز می‌توان بصورت برش خورده در محیط كشت قرار داد. برای این كار حتما در زیر هود بیولوژیك (BSC) كار كنید و بافت را با ملایمت و آرام آرام (gently) خورد كنید. نمونه‌های بافت خورد شده و هموژنیزه شده هر دو را در محیط‌های كشت مناسب تلقیح نمائید. هنگامی‌كه حضور یك ارگانیسم كپكی موكوراسئوس مورد شك و تردید است برای اجتناب از شكستن دیواره‌های سلولی این نوع از قارچ‌ها، خورد شدن بافت باید در حد تكه تكه كردن (sliced) باشد و نباید كاملا خورد (ground) شود.
اگر حضور هیستوپلاسما بعنوان پاتوژن مورد تردید است بافت باید در دستگاه خورد كن (tissue grinder) كاملا خورد شود. هیستوپلاسما بصورت مخمر تك سلولی، جوانه‌دار، و داخل سلولی در بافت مشاهده می‌شود. قطعات كوچكتر بافت كه با تكنیك grinding ایجاد می‌شوند سطح مواجهه‌ی بیشتری فراهم می‌آورد و سلول‌های مخمری بیشتری به محیط كشت وارد می‌شوند.
۸-۴- نگهداری و ذخیره كردن نمونه
آزمایشگاه‌ها باید یك سیاست مشخص و مدون برای نگهداری و ذخیره كردن نمونه‌ها براساس نیازهای كلینیكی خود تهیه و تدوین نمایند. بهترین حالت برای نگهداری نمونه‌های مو، پوست و ناخن نگهداری در دمای اتاق است. سایر نمونه‌های فرآوری شده را باید در دمای ۲ الی ۸ درجه سانتیگراد نگهداری نمود.
۹- آزمایش مستقیم نمونه‌های بالینی
۹-۱- آشكارسازی و افتراق قارچ‌ها در آزمایش مستقیم میكروسكپی
آشكارسازی (بخش ۹-۲ را مطالعه فرمائید) و مشخص كردن عناصر قارچی در نمونه‌های بیمار می‌تواند اطلاعات استوار و قانع كننده‌ای را فراهم نماید. قبل از هرچیز، حضور صرف عناصر قارچی در آزمایش مستقیم بصورت قوی حضور قارچ را با بیماری قارچی مرتبط می‌كند (بعنوان مثال افزایش مقدار عناصر قارچی در آزمایش مستقیم نسبت به كشت ضرورت دارد، زیرا در كشت حتی یك اسپور به تنهایی ممكن است تكثیر یافته و یك كلنی ایجاد كند).
در بسیاری موارد همبستگی بین نتایج آزمایش مستقیم میكروسكپی و برداشت قارچ در كشت یك مسئله اساسی برای كمك به تعیین اهمیت كلینیكی این نتایج است. در مقابل بدست آوردن نتایج در كشت، نتایج آزمایش مستقیم در یك زمان بسیار كوتاه میسر است و در برخی موارد می‌تواند بیانگر شواهد قطعی و اولیه‌ی عفونت قارچی باشد. در برخی دیگر از موارد برای نشان دادن حضور عفونت قارچی، آزمایش مستقیم نسبت به كشت می‌تواند ارجح باشد (مثال: نمونه‌های معینی از عفونت‌های ناشی از درماتوفیت‌ها). عموما كشت قارچی و آزمایش مستقیم میكروسكپی باید با یكدیگر انجام شوند (به ضمیمه‌ی A رجوع شود). در موارد دیگری نیز كشت می‌تواند برای آشكار كردن قارچ‌ها نسبت به آزمایش مستقیم بسیار حساس‌تر باشد و علاوه‌بر این كشت دارای این مزیت نیز هست كه امكان انجام آزمایش تعیین حساسیت نسبت به داروهای ضدقارچی را فراهم می‌آورد. اگر مقدار نمونه به اندازه‌ای نباشد كه آزمایش مستقیم و كشت هر دو انجام شود، انجام كشت بدون انجام آزمایش مستقیم، كمتر مطلوب می‌باشد.
انواع عناصر قارچی كه ممكن است در نمونه‌های بالینی حضور داشته باشند را به مخمرها، فرم‌های شبه مخمری، سودوهایفی، هایفی حقیقی، و سایر اشكال كمتر شایع می‌توان تمیز داد. توجه دقیق به مرفولوژی میكروسكپی به‌طور قابل توجهی احتمالات اتیولوژیكال را محدود می‌كند و در برخی از موارد (یا نمونه‌ها) موجب شناسایی قطعی نوع ارگانیسم قارچی می‌گردد. نوع پاسخ التهابی كه در برابر جنس و گونه‌ی قارچی ایجاد می‌شود نیز برای مشخص كردن عفونت‌های قارچی مفید و كمك كننده است.
۹-۱-۱- ویژگی‌های تشخیصی مخمرها و شبه مخمرها
قارچ‌های مخمری و شبه مخمری متنوع‌ترین اشكال میكروسكپی را در نمونه‌های بالینی تشكیل می‌دهند. این گروه از قارچ‌ها را به‌صورت اولیه می‌توان با كمك تجزیه و تحلیل در اندازه‌ی سلول‌های مخمری، همسانی یا غیرهمسانی در اندازه آن‌ها، و حضور یا عدم حضور سودوهایفی و یا وجود یا عدم وجود هایفی حقیقی در آن‌ها طبقه‌بندی كرد. علاوه‌بر این‌ها ممكن است ساختمان‌های اختصاصی نیز داشته باشند كه در این‌صورت تشخیص فرضی و احتمال حضور برخی از قارچ‌ها را فراهم می‌كنند (بعنوان مثال حضور كپسول در آزمایش مستقیم میكروسكپی در آزمایش مایع مغزی نخاعی كه اجازه می‌دهد شناسایی احتمالی و اولیه‌ی گونه‌های كریپتوكوكوس مطرح شود). اگرچه برای شناسایی دقیق قارچ‌های مخمری و شبه مخمری با توجه به تنوع و شیوع آن‌ها، تداخلات و یا اختلافات تشخیصی رخ داده كه باید بدرستی از یكدیگر شناخته شوند.
طبقه‌بندی قارچ‌های مخمری بر اساس اندازه به این شرح است:
قارچ‌های مخمری و شبه مخمری با اندازه‌ی كوچك یعنی ۲ تا ۵ میكرونی
قارچ‌های مخمری و شبه مخمری با اندازه متوسط یعنی ۶ الی ۱۵ میكرون
قارچ‌های مخمری و شبه مخمری با اندازه‌ی بزرگ یعنی بیش از ۱۵ میكرون
قارچ‌های مخمری و شبه مخمری با اندازه‌ی كوچك یعنی ۲ تا ۵ میكرونی سخت‌ترین قارچ‌ها برای افتراق از یكدیگر است. اگرچه توجه دقیق به جزئیات و مرفولوژی قارچ، محل عفونت، و در صورتی كه امكان داشته باشد نوع پاسخ التهابی اساسا احتمال شناسایی قارچ را بهبود می‌بخشند یا حداقل طبقه‌بندی آن‌ها را بعنوان عامل بیماری بطور مناسب‌تری ممكن می‌سازند (به جدول ۱ و ۲ و ۳ مراجعه شود).
| جدول ۱- توصیف صفات اختصاصی قارچ‌های مخمری و شبه مخمری در نمونه‌های بالینی
(مخمرهای با اندازه کوچک) |
||||
| نام ارگانیسم | اندازه (میکرومتر) | متحدالشکل یا دارای اندازه‌های متغیر | حضور سودوهایفی یا هایفی حقیقی | خصوصیات برجسته / ملاحظات خاص |
| کاندیدا گلابراتا
Candida glabrata |
۲٫۵-۴ | متحدالشکل و یک ریخت | غایب | کوچکترین گونه از جنس کاندیدا است، در نمونه‌های بالینی هایفی و سودوهایفی تولید نمی‌کند. |
| هیستوپلاسما کپسولاتوم
H. capsulatum |
۲-۵ | معمولا یک ریخت | معمولا غایب | در مقاطع بافتی، یک فضای شفاف یا کپسول کاذب اطراف مخمر دیده می‌شود. مخمرها کوچک، سلول‌های جوانه‌ای بیضوی تا کروی که اغلب در بیماری منتشره بصورت خوشه‌ای داخل هیستوسیت‌ها دیده می‌شوند. این سلول‌ها در هیستوپلاسمومای قدیمی و غیرفعال در نواحی نکروز وجود دارند. اگر به تعداد کم باشند آشکار کردن آن‌ها مشکل است. در اکثر موارد در مقاطع بافتی که با رنگ‌های هیستوشیمی رنگ‌آمیزی می‌شوند بهتر دیده می‌شوند. |
| گونه‌های مالاسزیا
.Malassezia spp |
۳-۸ (فرم‌های مخمری در تینا ورسیکالر)
<2-4 (اندازه مخمرها در فونژمی یا در حالت کومنسال) |
یک ریخت، بجز در تینا ورسیکالر که تغییرپذیری کمی دیده می‌شود | در تینا ورسیکالر دیده می‌شود | عناصر هایفال کوتاه و خمیده به همراه سلول‌های مخمری (شکل ظاهری مانند اسپاگتی و گوشت) در تراشه‌های پوستی که از بیماران تینا ورسیکالری بدست می‌آید. هنگامی‌که در نمونه‌های پوست و خون بیماران فونژمیک یافت می‌شوند، مخمرها جوانه زدن تک قطبی را نشان می‌دهند، جوانه‌ها دارای پایه‌ی پهن در نقطه‌ی اتصال هستند. |
| پنموسیستیس جیرووسی
Pneumocystis jirovecii |
۴-۶ | متحدالشکل و یک ریخت | غایب | اجسام کیست مانند که شبیه هلال‌های روبروی هم دیده می‌شوند برای این قارچ پاتوگنومونیک هستند و در رنگ‌آمیزی‌های بافتی بهتر مشاهده می‌شوند. کیست‌ها اغلب بصورت خوشه‌ای یا گروهی هستند. این ارگانیسم جوانه نمی‌زند. در اکثر موارد در مقاطع بافتی که رنگ‌آمیزی هیستوشیمی می‌شوند و یا در رنگ آمیزی DFA* بهتر دیده می‌شوند. |
| اسپوروتریکس شنکئی
Sporothrix schenckii species complex |
۲-۶ | متغیر، کروی و دراز | غایب | سلول‌های دراز (اجسام سیگار شکل) قویا مطرح کننده اسپوروتریکس شنکئی هستند. این عفونت معمولا یک پاسخ پیوگرانولوماتوز را برانگیخته میکند. ممکن است فرم‌های مخمری در نمونه‌های بالینی به سختی تشخیص داده شوند. آن‌ها در مقاطع بافتی با استفاده از رنگ‌آمیزی‌های هیستوشیمیائی بهتر مشاهده می‌شوند. |
توضیح: *DFA: Direct Fluorescent Antibody
تصاویر منتخبی از برخی از عناصر قارچی مخمری مرتبط با جدول شماره ۱ در زیر آورده شده است:
| جدول ۲- توصیف صفات اختصاصی قارچ‌های مخمری و شبه مخمری در نمونه‌های بالینی (مخمرهای با اندازه متوسط) |
||||
| نام ارگانیسم | اندازه (میکرومتر) | متحدالشکل یا دارای اندازه‌های متغیر | حضور سودوهایفی یا هایفی حقیقی | خصوصیات برجسته/ملاحظات خاص |
| عوامل کروموبلاستومایکوزیس
Agents of Chromoblastomycosis |
۵-۱۲ | متغیر | غایب | مشاهده‌ی ساختمان‌های کروی که با یکدیگر اتصال دارند و دارای دیواره‌های عرضی داخلی هستند برای تشحیص اهمیت دارند (اجسام اسکلروتیک). معمولا پیگمانتاسیون آشکاری مشاهده می‌شود. |
| بلاستومایسس درماتیتیدیس
B. dermatitidis |
۸-۱۵ | متحدالشکل و یک ریخت | هیچ‌کدام | سلول‌ها معمولا بزرگ، کروی شکل و با انکسار مضاعف هستند. جوانه‌ها معمولا یک عدد و با اتصال پهن به سلول مادر چسبیده‌اند. بندرت فرم‌های کوچک ۲ تا ۵ میکرونی و فرم‌های بزرگ تا ۴۰ میکرونی ممکن است مشاهده شوند. |
| گونه های کاندیدا غیر از کاندیدا گلابراتا
Candida spp. Other than C. glabrata |
۲٫۵-۷٫۵
اکثرا به اندازه ۵-۶ |
بطور متوسط متغیر | اغلب وجود دارد | سلول‌ها معمولا تک جوانه‌ای هستند. موقعی که سودوهایفی حضور دارد انتهای سلول‌ها فشرده شده و بصورت متصل با یکدیگر باقی می‌مانند و شبیه به زنجیر سوسیس دیده می‌شوند. هایفی حقیقی اگر دیده شود دارای دیواره‌های موازی بوده و septate است. |
| کریپتوکوکوس نئوفرمنس
C. neoformans |
۲-۱۵ | متغیر | خیلی بندرت | سلول‌ها در اندازه متنوع هستند و معمولا کروی می‌باشند. جوانه‌ها معمولا منفرد هستند و اتصال نقطه‌ای دارند. کپسول ممکن است مشاهده شود و یا دیده نشود. |
| گونه‌های اگزوفیالا
.Exophiala spp |
۴-۶ | متغیر | وجود دارد | سلول‌های شبه مخمری که از طریق annelloconidiation غیرجنسی تکثیر می‌شوند به همراه عناصر شبیه سودوهایفی حضور دارند. پیگمانتاسیون تیره ممکن هست از حالت کم چگال و نامحسوس تا کاملا آشکار دیده شود. |
| هیستوپلاسما دوبوئیزی
Histoplasma duboisii |
معمولا ۸-۱۵
گاهی تا ۱۵۰ |
متغیر | غایب | قارچ یک پایه‌ی باریک به نمایش می‌گذارد و گاهی شبیه به ساعت شنی یا شبیه به عدد ۸ است. به دلیل اندازه‌ی سلول و دیواره‌ی ضخیم آن، گاهی اوقات این ارگانیسم اشتباها بجای بلاستومایسس در نظر گرفته می‌شود. |
تصاویر منتخب از برخی از عناصر قارچی مخمری مرتبط با جدول شماره ۳ در زیر آورده شده است:
| جدول۳- توصیف صفات اختصاصی قارچ‌های مخمری و شبه مخمری در نمونه‌های بالینی
(مخمرهای با اندازه بزرگ) |
||||
| نام ارگانیسم | اندازه (میکرومتر) | متحدالشکل یا دارای اندازه‌های متغیر | حضور سودوهایفی یا هایفی حقیقی | خصوصیات برجسته /ملاحظات خاص |
| گونه‌های کوکسیدیوئیدس
.Coccidioides spp |
۱۰-۲۰۰ | متغیر | معمولا وجود ندارد | اسفرول‌ها اندازه‌های متنوعی دارند و برخی از آن‌ها محتوی اندوسپور هستند. اسفرول‌های عقیم یا نابالغ نیز ممکن است دیده شوند. هنگام پاره شدن اندوسپورهای آزاد شده و اسفرول‌های نابالغ ممکن است شبیه به مخمرهای جوانه‌دار دیده شوند. این اسفرول‌های نابالغ که در کنار اندوسپورها قرار می‌گیرند ممکن است مشابه بلاستومایسس درماتیتیدیس به نظر برسند در حالی‌که اندوسپورها ممکن است مشابه هیستوپلاسما به نظر آیند. غیاب حالت جوانه زدن یک وجه افتراقی مهم در تشخیص این قارچ است. در لزیون‌های حفره‌ای ممکن است هایفی دیده شود. این هایفی‌ها در مقاطع بافتی که با رنگ‌های هیستوشیمی رنگ‌آمیزی شده‌اند بهتر دیده می‌شوند. |
| کوکرومایسس رکورواتوس
Cokeromyces recurvatus |
۳۰-۹۰ | متغیر | غایب | سلول‌ها مشابه سلولهایی است که در پاراکوکسیدیوئیدومایکوزیس دیده می‌شوند، هر چند که اغلب اوقات با اسفرول‌های کوکسیدیوئیدس اشتباه گرفته می‌شوند. |
| پاراکوکسیدیوئیدس برازیلینسیس
P. brasiliensis |
۵-۶۰ | متغیر | غایب | سلول‌ها معمولا بزرگ هستند و بوسیله‌ی جوانه‌های کوچکتری احاطه شده‌اند (منظره شبیه به فرمان کشتی). سلول‌های دختر و کوچکتر (۲ تا ۵ میکرون) شبیه هیستوپلاسما کپسولاتوم ممکن است دیده شوند. |
تصاویر منتخب از برخی از عناصر قارچی مخمری مرتبط با جدول شماره ۳ در زیر آورده شده است:
M54A- Principles and Procedures for Detection of Fungi in Clinical Specimens—Direct Examination and Culture; Approved Guideline. October 2012
