هیستوگرام گلبول های قرمز

ترجمه و تنظیم: دکتر محمد قهری

هیستوگرام گلبول های قرمز در حال حاضر به‌صورت یك بخش كامل‌كننده و ضروری در تمام دستگاه‌های خودكار تجزیه‌كننده خون در دسترس است. شرایط و وضعیت‌های مختلف هماتولوژیكی غیرنرمال اثرات خود را در هیستوگرام نشان می‌دهد و با مشاهده‌ی این هیستوگرام و دیگر پارامترهای CBC می‌توان از آن به‌عنوان كلیدی در تشخیص و مدیریت اختلالات گلبول های قرمز  كمك گرفت. علاوه‌بر این همراه با مشاهده‌ی گسترش خون محیطی به‌عنوان كمك در پایش و تفسیر تغییرات مورفولوژیكی آبنرمال به‌ویژه در مورد جمعیت‌های دوشكلی گلبول های قرمز می‌توان از آن استفاده کرد.

این مقاله در مورد برخی از اشكال مورفولوژیكی دیمرفیسم و اثرات و تغییرات ناشی از آن در هیستوگرام های گلبول قرمز بحث می‌كند.

به هنگام تفسیر، یك هیستوگرام ارزش معادل هزاران عدد و رقم را دارد. در اینجا داده‌های زیادی به‌صورت یك تصویر نشان داده می‌شود كه می‌تواند اطلاعات را بهتر از اعداد فشرده نشان دهد. در هماتولوژی این داده‌ها به چند فرم ارائه می‌شوند كه یكی از آن‌ها هیستوگرام گلبول های قرمز است.  مشاهده هیستوگرام گلبول های قرمز یك معنی و مفهوم اولیه از دامنه، اندازه، شكل و دیگر خصوصیات مورفولوژیك گلبول قرمز را بدست می‌دهد. هیستوگرام گلبول های قرمز یك نمایشگر گرافیك انتشار اندازه ذرات، امروزه به‌صورت روتین در تجزیه‌گرهای سلولی خودكار به‌عنوان یك بخش استاندارد وجود دارد. این هیستوگرام در رابطه با دیگر پارامترهای CBC مانند پهنای توزیع گلبول قرمز (RDW) و حجم متوسط گلبول قرمز (MCV) در شرایط هماتولوژیكی مختلف آبنرمال می‌باشد و ممكن است راهنما و كلید عمده‌ای در تشخیص و مدیریت اختلالات هماتولوژیكی مهم گلبول های قرمز باشد.

جدول شماره 1 وضعیت‌های مرتبط با تغییرات دیمورفیك گلبول های قرمز را لیست كرده است. قبل از گزارش نتایج مربوط به گلبول های قرمز، یك تفكیك واضح بین جمعیت‌های دیمورفیك و دوگانه باید صورت گیرد. در یك تصویر دیمورفیك هیستوگرام ممكن است دو یا چند جمعیت گلبول های قرمز داشته باشد درحالی‌كه در جمعیت‌های دوگانه هیستوگرام 2 جمعیت گلبول قرمز مشخص و مجزا دارد (مانند گلبول های قرمز هیپوكرومیك – میكروسیتیك و نورموكرومیك – نورموسیتیك).

این 2 جمعیت مشخص ممكن است شامل سلول‌های خود بیمار (بعد از درمان با آهن) و یا مخلوطی از سلول‌های بیمار و دهنده (بعد از ترانسفوزیون) باشد. اگرچه این نوع طبقه‌بندی اختیاری است، واژه دیمورفیك كمتر محدودكننده است و بنابراین به‌صورت وسیعی استفاده می‌شود و می‌تواند برای جمعیت‌های گلبولی دوگانه یا چندگانه به‌كار گرفته شود. بنابراین تصویر دیمورفیك خونی مشابه جمعیت دوگانه میكروسیتیك و نورموسیتیك (تصویر 1-A) یا سلول‌های نورموسیتیك و ماكروسیتیك و یا مخلوطی از سلول‌های نرمال و كوچك و سلول‌های بزرگ با اندازه و شكل‌های مختلف است (تصویر B-1). برخی اشكال مورفولوژیكی دیمرفیسم و تغییرات مشخصه مربوط در هیستوگرام های گلبول قرمز در این مقاله بحث می‌شود.

هیستوگرام RBC : مروری اجمالی

شمارش و اندازه‌گیری گلبول های قرمز در دستگاه‌های كولتر اساس و پایه‌ای برای ایجاد هیستوگرام های گلبول قرمز فراهم كرده‌است. این روش بر روی تغییر در كنداكتانس (میزان رسانایی) هر سلول كه از دهانه یا سوراخ (aperture) عبور می‌كند تكیه می‌نماید. تغییر در كنداكتانس موجب یك پالس الكتریكی می‌شود كه دامنه آن بستگی به حجم سلول دارد.

آنالایزر 256 كاناله از تعدادی آستانه برای دسته‌بندی كردن سلول‌ها با توجه به حجم‌های مختلف برای رسم هیستوگرام گلبول قرمز استفاده می‌كند. هر كانال برروی محور ایكس‌ها اندازه اختصاصی (حجم) برحسب فمتولیتر (24 الی 360 فمتولیتر) كه از سمت چپ به راست افزایش می‌یابد. محور Yها تعداد سلول‌ها در هر كانال را نشان می‌دهد. هر سلولی كه در كانال انبار می‌شود نشان‌دهنده اندازه آن است، بنابراین بعد از آنكه انباشت داده‌ها كامل شد تعداد نسبی سلول‌ها (فركانس) فراهم شده‌است. این داده‌ها به‌وسیله كامپیوتر پروسس می‌شوند و منحنی گلبول های قرمز به‌وسیله‌ی تكنیك حركت متوسط صاف می‌شود و برروی یك سیستم مدیریت داده‌ها نمایش داده می‌شود.  تصویر A-1 یك هیستوگرام نرمال و تیپیك گلبول های قرمز را نشان می‌دهد.

ارزش هیستوگرام گلبول قرمز

یك هیستوگرام همانطور كه در تصاویر شماره 1 و 2 نشان داده‌شده‌است یك نمایش گرافیك از یك كلكسیون از داده‌ها بر اساس تعداد و یا اندازه‌ی سلول‌ها است كه مجسم‌كننده‌ی اختلافات در فرآیند است. گاهی اوقات به‌عنوان یك فركانس از منحنی توزیع ارجاع داده می‌شود. از آنجا كه تصاویر گرافیكی می‌توانند داده‌ها را از طریق راه‌های معنی‌دار و به‌سرعت قابل فهم نشان دهند، هیستوگرام یك ابزار قدرتمند در آنالیز مورفولوژیكال گلبول های قرمز است. هیستوگرام گلبول های قرمز ما را قادر می‌سازد تا داده‌های تجربی را كه تغییرات مورفولوژیكال را به‌صورت گرافیكی به شكل نقطه‌ها، قله‌ها یا شكاف‌ها یا به‌صورت یك خط از منحنی فركانس را نشان می‌دهد آنالیز و تفسیر كنیم. هیستوگرام اجازه می‌دهد تا مستقیما مقایسه‌ی بصری مركز و گسترش داده‌ها و داده‌هایی كه شامل 2 یا چند متغیر است درك شوند.

در زمان‌هایی یك هیستوگرام می‌تواند اطلاعات فوق‌العاده گرانبهایی را فراهم كند كه ممكن است حتی در داده‌های عددی اتومات شده آشكار نباشد. به‌عنوان مثال در آنمی مگالوبلاستیك كه همراه با فقر آهن شده است برخی از سلول‌های هیپوكرومیك و میكروسیتیك را می‌توان در هیستوگرام شناسایی كرد اما ممكن است در داده‌های عددی منعكس نشود و این ممكن است اولین كلید در یك پیشامد ناشایع باشد. به همین ترتیب فقر آهن ممكن است بی سروصدا و به‌صورت پنهانی در طول فرآیند برخی دیگر از بیماری‌ها توسعه یابد (مثل پلی‌سیتمی اولیه) با شمارش سلولی نرمال و اندكس‌ها بجز RDW كه افزایش یافته‌است. هیستوگرام گلبول های قرمز نیز آبنرمال است و شانه‌ای از گلبول‌های میكروسیتیك را نشان می‌دهد. علاوه‌بر این یك هیستوگرام می‌تواند اطلاعات مفیدی به شرح زیر برای آزمایشگاه فراهم كند:

1. پایش اطمینان و اعتبار نتایج بدست آمده توسط آنالایزرها
2.  تحقیق و بررسی علل بالقوه‌ی نتایج مغلوط (پر از اشتباه) اتوماتیك
3. رسیدن به تشخیص فرضی

به‌عنوان مثال موقعیت‌ها و وضعیت‌های ویژه‌ای مثل حضور گلبول های قرمز قطعه قطعه شده یا حالت آگلوتیناسیون كه ممكن است بدون آزمایش گسترش خونی زودتر شناسایی نشود، در صورتی‌كه قاعدتا بر روی هیستوگرام گلبول های قرمز آشكار می‌شود. به همین صورت در بیماران با آنمی فقرآهن یا آنمی مگالوبلاستیك تحت درمان یك هیستوگرام متوالی می‌تواند به روشنی و وضوح تظاهرات پیشرونده‌ی جمعیت اریتروسیتی جدید را به‌خوبی نشان دهد. ظاهر شدن شانه‌ی راست معمولا با حضور رتیكولوسیت‌ها مطابقت دارد ( تصویر شماره j-1) و این مسئله همزمان است با پیشرفت در سایر پارامترهای عددی، یك نشان و اثری از جمعیت اریتروسیتی در قسمت منتهی الیه راست هیستوگرام مربوط به آگلوتیناسیون گلبول های قرمز است (تصویر f-1).

شیفت به سمت چپ در هیستوگرام به میكروسیت‌ها دلالت دارد (تصاویر B-1 و ‍‍C-1) و شیفت به سمت راست حضور ماكروسیت‌ها را مطرح می‌كند (تصاویر D-1 و E-1).

هیستوگرام‌های دو مدلی (bimodal) مانند تصاویر L-1 ,K-1 ,G-1, F-1 و 2-B تا 2-E معمولا با ترانسفوزیون و یا پاسخ به عمامل هماتینیك به آنمی میكروسیتیك و ماكروسیتیك ارتباط دارند، اما همچنین نشان‌دهنده‌ی اختلالات هماتولوژیك دیگر مطابق با آنچه در جدول شماره 1 نشان داده شده می‌باشند.

 اگرچه دامنه‌ی اندازه برای هیستوگرام های گلبول قرمز بین 24 و 360 فمتولیتر است، دستگاه‌ها تنها سلول‌هایی را به‌عنوان گلبول قرمز می‌شمارد كه حجم آن بین 36 و 360 فمتولیتر باشد. سلول‌هایی كه در دامنه‌ی 24 تا 36 فمتولیتر باشند رد می‌شوند و در شمارش گلبول های قرمز قرار نمی‌گیرند، البته شمارش می‌شوند و نمایش هم داده می‌شوند: در ناحیه ‌هیستوگرام بین دامنه‌ی 24 و 36 فمتولیتر و انتهای تحتانی هیستوگرام را نمایش می‌دهند. به‌طور طبیعی فضای زیر 36 فمتولیتر شفاف باقی می‌ماند اما در موقعیت‌های خاص، هیستوگرام ممكن است بالای خط پایه شروع شود و یا یك جهش و خیز بلندی در قسمت انتهای چپ منحنی نشان دهد (تصویر G-1 تا تصویرL-1) كه عموما نشان‌دهنده‌ی وجود ذرات كوچك است. این ذرات شامل قطعات و تكه‌های گلبول های قرمز، میكرواسفروسیت‌ها، گلبول های قرمز هسته‌دار، گلبول های قرمز لیز نشده، الیپتوسیتوزیس، ماكروترومبوسیت‌ها، كلامپ‌های پلاكت، باكتری‌ها، ارگانیسم‌های پارازیتیك و دیگر مواد مداخله كننده مثل كرایوگلبولین، آگلوتینین سرد و ماكروگلبولینمی است.

آنالیز و تفسیرهای هیستوگرام های تصاویر 1 و 2

هیستوگرام های گلبول قرمز انتخاب شده وضعیت‌های معمولی هماتولوژیك مختلف و مراحل مختلف بعد از درمان آنمی فقر آهن را نشان می‌دهند. با نگاه‌كردن به شكل انتشار داده‌ها یك هیستوگرام گلبول قرمز را می‌توان تفسیر نمود. شكل توزیعی هیستوگرام با منعكس‌كردن جمعیت‌های یك شكل یا دیمورفیك و یا چندگانه‌ی گلبول های قرمز طبقه‌بندی می‌شود. در یك جمعیت یك شكل (single) هیستوگرام ممكن است به‌صورت یك منحنی زنگی شكل نرمال (Gaussian) نشان داده شود. ممكن است پهن شده باشد و شیفت به سمت چپ یا راست داشته‌باشد یا نداشته‌باشد، ممكن است به سمت چپ یا راست متمایل شده‌باشد (skewed) یا اینكه ممكن است تركیبی از تمام این موارد را نشان دهد.

در جمعیت‌های دیمورفیك هیستوگرام ممكن است سیمتریك و یا دو نمائی (bimodal) باشد و یا دونمائی اما متمایل شده به چپ یا راست باشد.

حالت مركزگرایی و پهنای هیستوگرام تنوع و حد و اندازه و وسعت اندازه‌ی گلبول های قرمز را تعریف می‌كند. به‌صورت بالقوه فاكتورهای متعددی ممكن است بر روی هیستوگرام گلبول قرمز تاثیر بگذارند. این فاكتورها شامل همزمانی گلبول‌های قرینه‌ی یکدیگر، آگلوتیناسیون گلبول‌ها، انكلوزیون رتیكولوسیت‌ها، گلبول‌های بالغ، تغییر در شكل گلبول‌ها، و انكلوزیون لكوسیت‌ها در بیماری‌های خاص باشد. با توجه به تاثیر این فاكتورها بر شكل هیستوگرام مطابق با آن بر روی هر اندازه‌گیری كه از هیستوگرام به‌دست آمده نیز اثرات متفاوتی می‌گذارند. برای كاهش اثرات این مشكلات سازندگانِ دستگاه‌ها و سیستم‌های معرف، آن‌ها را طوری طراحی كرده‌اند كه اختصاصا از این مداخلات جلوگیری كرده و آن‌ها را اصلاح نمایند. آن‌ها الگوریتم‌های ریاضی را برای شمارش ذرات و تولید داده‌های عددی، داده‌های گرافیكی توسعه داده‌اند و نظریه‌های تفسیركننده‌ای كه استفاده‌كنندگان را یاری دهد یا هوشیار سازد برای نتایج بالقوه غیرصحیح ارائه كرده‌اند. علاوه‌بر این برای جلوگیری از مداخله‌گرها در محاسبات RDW ، اطلاعات زیر 20% از نمودار در هیستوگرام گلبول های قرمز مستثنی شده‌است (تصویر 3). این داده‌های اشتباه شامل همزمانی سلولی، آرتیفكت‌های مربوط به روزنه (aperture)، دوبلت و تریپلت و آگلوتینه‌ها در قسمت راست و كلامپ‌های پلاكت و مگاترومبوسیت‌ها روی قسمت چپ هیستوگرام گلبول قرمز است.

آشنایی با هیستوگرام‌های تایپیکال کمک می‌کند تا ارزیابی مشتقات قابل توجه آن آسان‌تر صورت گیرد. آشنا بودن با طرح کلی هیستوگرام‌های منظم همان‌طور که در شکل A-1 تا D-1 نشان داده شده است قبل از مطالعه بر روی گراف‌های هیستوگرام کمپلکس لازم است. در این منظر برای حداکثر بهره‌برداری از یک هیستوگرام یک منحنی نرمال رفرانس را ترسیم می‌کنند (مثل منحنی نرمال قرینه با MCV برابر 96 فمتولیتر و ضریب پهنای توزیع (RDW-cv) گلبول های قرمز معادل 15%) این منحنی به‌طور اتوماتیک برروی هر هیستوگرام RBC قرار گرفته است و بنابراین هر مشتق قابل تشخیص از آن منحنی را می‌توان به‌طور واضح و آشکار برای مقایسه مورد بررسی قرار داد.

هنگام مرور یا آنالیز هیستوگرام‌ها باید به نكات مهم زیر توجه داشت:

• وضعیت جمعیت‌های انفرادی در مقایسه با وضعیت تیپیکال یا نرمال
• مقدار جداسازی بین جمعیت‌ها در مقایسه با جداسازی تیپیکال/ نرمال
• غلظت نسبی هر جمعیت در مقایسه با غلظت‌های تیپیکال/ نرمال
• وجود جمعیت‌های غیرمنتظره یا غیرتیپیک

تصویر A-1 تا D-1 نمونه‌های تیپیک هیستوگرام های گلبول قرمز نرمال، میکروسیتیک و ماکروسیتیک هستند. آن‌ها منحنی‌های نرمال قرینه، تک موج، و زنگی شکل می‌باشند. منحنی قرینه منحنی است که هنگام تا زدن کاملا روی هم قرارگیرد و یا تقریبا تصویر آئینه‌ای همدیگر باشند. هنگامی که توزیع قرینه نباشد منحنی به یکی از دو طرف راست یا چپ بیشتر از طرف دیگر متمایل می‌شود. در یک هیستوگرام نرمال اکثریت سلول‌ها بین 55 و 125 فمتولیتر قرار می‌گیرند. دنباله‌ی توزیع شامل پالس‌های غیرعادی (بی‌قاعده) و آن‌هایی است که به‌طور همزمان بر روی هم قرار گرفته‌اند. در آنمی فقرآهن و بتاتالاسمی توزیع منحنی‌های RBC به سمت چپ شیفت پیدا کرده‌اند و درصد میکروسیتوزیس افزایش یافته است. اگرچه هیستوگرام‌های آن‌ها مشابه هم است، درجه و شدت آنیزوسیتوزیس (که بوسیله‌ی RDW اندازه‌گیری می‌شود) آن‌ها را از یکدیگر متمایز می‌سازد. آنمی فقر آهن بوسیله‌ی RDW افزایش یافته مشخص می‌شود که منعکس‌کننده‌ی هتروژنیتی در جمعیت‌های اکتسابی اریتروسیتی است. در تالاسمی (trait) با توجه به هموژنیتی جمعیت ارثی اریتروسیت‌ها RDW معمولا در دامنه‌ی نرمال قرار می‌گیرد. این اختلاف تا اندازه‌ای برای تشخیص این دو از یکدیگر مفید است اما در مواردی که آنمی شدید را دربرمی‌گیرند، میکروسیتوزیس هموژنوس ممکن است نتایج گمراه‌کننده‌ای بدهند. با این حال بیمارانی که آنمی شدید نشان می‌دهند با هموگلوبین کمتر از 90g/l و با گلبول‌های قرمز هیپوکرومیک – میکروسیتیک احتمالا (80%) فقر آهن دارند.

نکات هشداری و احتیاطی هنگام مشاهده و تفسیر RDW

شمارشگرهای اتوماتیک برای اندازه‌گیری RDW از دو روش استفاده می‌کنند. در روش اول RDW-CV (تصویر 3) در نظر گرفته می‌شود. در این روش نسبت یک انحراف معیار (1SD) به MCV محاسبه می‌شود و از آنجایی‌که این یک نسبت است تغییرات در SD یا MCV بر روی نتایج اثر خواهد گذاشت. حالت میکروسیتوز تمایل دارد که RDW-CV را به سادگی به‌وسیله‌ی کاهش مخرج کسر (MCV) در این نسبت افزایش دهد، در نتیجه RDW احتمالا یک پارامتر بسیار حساس در اختلالات میکروسیتی نسبت به اختلالات ماکروسیتی است. برعکس ماکروسیتوز با افزایش مخرج کسر ممکن است تغییر در SD را تعدیل کند و مقدار RDW-CV را کاهش دهد. یک جمعیت با MCV بزرگ ممکن است در هیستوگرام پهن‌تر به نظر بیاید اما یک RDW-CV نرمال را نشان دهد. به همین صورت یک جمعیت با MCV خیلی کوچک ممکن است هیستوگرام آن کوچک‌تر به‌نظر برسد اما یک RDW-CV بزرگ را نشان دهد.

دومین روش محاسبه RDW تحت عنوان RDW-SD موسوم است که غیروابسته به MCV می‌باشد. محاسبه‌ی آن به‌صورت یک اندازه‌گیری مستقیم پهنا بر حسب فمتولیتر با سطح تکرار 20% بر روی منحنی گلبول قرمز است (تصویر شماره 3).

RDW-SD اندازه‌ی پراکندگی مقادیر در اطراف میانگین است. هرچقدر که داده‌ها گستردگی بیشتری داشته باشند مقدار SD بالاتر است و بالعکس.

RDW-CV اندازه‌گیری دیگری است در رابطه با پراکندگی داده‌ها در اطراف میانگین و بیانگر نسبت 1SD به میانگین است. هرچند که هر دو روش برای اندازه‌گیری درجه‌ی آنیزوسیتوز از SD استفاده می‌کنند ولی تنوع سلولی را از راه‌های مختلفی اندازه‌گیری می‌نمایند.

تصویر E-1 یک هیستوگرام گلبول قرمز آبنرمال مربوط به آنمی مگالوبلاستیک با RDW-CV برابر 35/7 % و RDW-SD  معادل 172/8 فمتولیتر را  در نظر بگیرید. در حالیکه هر دو نتایج بالا است آشکارا RDW-SD نسبتا بالاتر از RDW-CV است. علت احتمالی این مسئله این است که پراکندگی به‌وسیله‌ی فرمول RDW-CV اندازه‌گیری شده است: یعنی 1SD  تقسیم بر MCV.

1SD که در فرمول قرار دارد توانایی و قابلیت آن را به اختلاف یا تنوع اندازه‌گیری در محدوده‌ی 1SD± محدود می‌کند. در نتیجه سلول‌های آبنرمال دیگر خارج از 1SD± از تخمین خارج می‌شوند و از این رو نتایج RDW-CV در مقایسه (به‌طور نسبی) پائین بدست می‌آیند. علاوه‌بر این مخرج کسر (MCV) یک اندازه‌گیری پراکندگی نیست اما می‌تواند روی نتایج RDW-CV – وابسته به مقدار متوسط آن اثر بگذارد. در این حالت مقدار  MCV بالای 127/8 فمتولیتر اثر SD بالا را موازنه برقرار می‌کند، از این روی کاهش بعدی در RDW-CV.

بنابراین، این روش برای ارزیابی هیستوگرام‌های خیلی آبنرمال توصیه نمی‌شود هرچند که ارتباط و همبستگی بهتری را به‌عنوان یک اندیکاتور آنیزوسیتوز وقتی‌که MCV در دامنه‌ی پایین نرمال است نشان می‌دهد و آشکارکردن آنیزوسیتوز آن‌طور که در فقرآهن دیده می‌شود مشکل است. آن همچنین یک روش خوب برای پایش اثر درمان آهن و افتراق آنمی فقر آهن از تالاسمی (trait) می‌باشد. از طرف دیگر از آنجایی‌که RDW-SD یک مقیاس یا مقدار مستقیم در عرض هیستوگرام است، این یک اندازه‌گیری بهتر و دقیق‌تر برای آنیزوسیتوز به‌ویژه در هیستوگرام‌های بسیار غیرنرمال است. به‌نظر می‌رسد که وضعیت مورفولوژیکی واقعی و یا پاتولوژیکی بیماران را بیان می‌کند همانطور که تمامی طیف اندازه‌های MCV را در برمی‌گیرد. به‌عبارت دیگر برخلاف RDW-CV سلول‌های بزرگ و کوچک آبنرمال به درجات مختلف آنیزوسیتوز و یا پوئیکیلوسیتوز خارج از 1SD± در اندازه‌گیری قرار می‌گیرند و از این روی نتایج نسبتا بالای RDW-SD بدست می‌آید. به نظر می‌رسد که هرچقدر که RDW بالاتر باشد درجه‌ی آنیزوسیتوز و یا پوئیکیلوسیتوز بیشتر است. با درنظر گرفتن این مطالب منطقی به نظر می‌رسد که تکنولوژیست‌هایی که اسلایدهای هماتولوژی را بررسی می‌کنند باید به نتایج RDW-CV و RDW-SD هردو دسترسی داشته باشند تا هم بتوانند مروری مقایسه‌ای داشته باشند و هم نتایج را بهتر به یکدیگر ارتباط دهند.

ماکروسیتوز

ماکروسیتوز با یک MCV بالاتر از 100 فمتولیتر و یک RDW نرمال در 3 تا 5 درصد افراد بزرگسال یافت می‌شود و بخش قابل‌توجهی از آن‌ها ممکن است آنمی نداشته باشند (تصویر 1-D). بر طبق گفته‌ی Gulati، گلبول های قرمز ماکروسیتیک کمتر از 25% با MCV معادل 95 تا 110 فمتولیتر به‌لحاظ مورفولوژیکی به‌صورت یک مثبت (1+) درجه‌بندی می‌شوند. همبستگی بین سطوح درجه‌بندی شده‌ی ماکروسیتوز (یا سایر وضعیت‌ها) و MCV باید به‌کمک میکروسکوپ تائید و تصدیق شود.

آنمی مگالوبلاستیک

بیماران با آنمی ماکروسیتیک مربوط به کمبود ویتامین B12 / فولات ممکن است گاهی اوقات یک موج تک و عریضی از سلول‌های خیلی کوچک و قطعات گلبول قرمز در سمت چپ تا سلول‌های ماکروسیتیک که به‌اندازه‌ی 250 فمتولیتر هم می‌رسند در قسمت راست را نشان دهند (تصویر E-1). توجه کنید که تعداد زیادی از سلول‌های کوچک که به‌صورت یک جهش بلند در سمت چپ نشان داده شده‌اند در بالای 20% خط باریک فرکانس قرار دارند. در نتیجه آن‌ها در تعیین MCV و RDW شامل شده‌اند و به‌ترتیب موجب کاهش و افزایش مقادیر به‌صورت کاذب شده است. در آنمی مگالوبلاستیک شدید هیستوگرام‌های WBC و پلاکت مانند شمارش و مورفولوژی می‌توانند اطلاعات اضافی مفیدی بدهند. تصویر F-1 تا تصویر L-1 و تصویر B-2 تا تصویر G-2 چهره‌های متعدد و مکانیسم‌های دی مرفیسم را نشان می‌دهند. در حالیکه ارتباط دادن دی مرفیسم یک پروسه‌ی راحت و بی‌دردسر است باید تاکید شود که مکانیسم‌های متعددی گاهی اوقات درگیر می‌شوند. هنگامیکه 2 نوع جمعیت سلولی وجود داشته باشد یا اینکه پیک‌های متعددی در هیستوگرام وجود داشته باشد جمعیت دی مرفیک ایجاد می‌شود.

آگلوتیناسیون سرد

به‌دلیل اینکه این حالت یک واکنش وابسته به زمان، دما و تیتر آگلوتینین است منحنی‌های فرکانس ممکن است در شکل‌ها فرق کند (تصویر F-1). یک شکل منحنی شبیه به حرف U معمولا مطرح‌کننده‌ی حضور دو جمعیت جداگانه است یعنی در هر طرف یک نوع جمعیت سلولی قرار می‌گیرد. اگرچه در این حالت هیستوگرام گلبول قرمز آبنرمال نتیجه‌ی یک تیتر بالای آگلوتینین سرد است که باعث می‌شود RBCها آگلوتینه شوند و با اندازه و تعداد آن‌ها مداخله شود. برخی از دستگاه‌های تجزیه‌گر با کمک برنامه‌های روشنگری (flags) و پیام‌ها ممکن است یک پرچم (flag) مربوط به آگلوتیناسیون RBC را نشان دهند. خط‌های فاصله (–) جایگزین داده‌ها برای RDW می‌شوند و علامت ستاره (*) بر روی اکثر پارامترهای RBC ظاهر می‌شود. علامت ستاره‌ نشان می‌دهد که این نتایج غیرقابل اعتماد هستند و باید برطبق دستورالعمل آزمایشگاه به‌دقت مرور شوند. به‌عبارت دیگر علی رغم هیستوگرام‌های آبنرمال دستگاه‌های دیگر هنوز RDW را تنها با استفاده از جمعیت عمده‌ی سلول‌ها اندازه‌گیری و محاسبه می‌کنند. جمعیت‌های کوچکتر (مینور) و میانگین در جهت اجتناب از مداخله در محاسبه‌ی RDW مستثنا می‌شوند. فرکانس بالای ثبت شده در قسمت چپ هیستوگرام می‌تواند مربوط به اثر تیتر بالای آنتی بادی مداخله‌کننده در جداسازی سلولی باشد. از آنجاکه گلبول های قرمز دوتایی یا 3 تایی به‌عنوان یک سلول شمارش می‌شوند و کلامپ‌های بزرگ سلول‌ها از شمارش نادیده گرفته می‌شوند تغییرات در شمارش سلول‌ها و حجم آن‌ها روی تمام پارامترهای CBC به‌جز هموگلوبین اثر می‌گذارد. درجات متفاوت آگلوتیناسیون در این وضعیت منحنی‌های هیستوگرام مختلفی را با مقادیر مختلف نتیجه می‌دهد. دنباله‌های گلبول های قرمز در قسمت انتهایی راست گراف دیده می‌شود.

آنمی سیدروبلاستیک

این یک مثالی از توزیع دو مودالی با 2 نقطه‌ی مجزای کوچک و بلند (تصویر G-1) می‌باشد. برای ایجاد یک توزیع منفرد 2 جمعیت RBC باید در کمتر از 15% در حجم با هم تفاوت داشته باشند. به نظر می‌رسد که توزیع اندازه‌ی ذرات خیلی پهن است از یک گروه از سلول‌های خیلی کوچک که بوسیله‌ی یک جهش بلند در خط پایه‌ی منحنی نشان داده می‌شود تا یک گروه از سلول‌های نرمال و ماکروسیتیک که به‌طور برابری در طرف دیگر گسترش پیدا کرده‌اند. گروه‌ها خودشان دامنه‌ها (مقادیر) مختلفی از مقادیر را نشان می‌دهند بنابراین ست‌های کلی نتایج واقعا گسترده‌اند. به‌عبارت دیگر آن مخلوطی از سلول‌های کوچک، نرمال و بزرگ در جمعیت‌های مختلف است. نتایج اندیس‌های گلبول قرمز اگرچه در دامنه‌ی نرمال قرار می‌گیرند و اگر تنها به اندیس‌ها توجه شود یافته‌های مهم مربوط به جمعیت‌های مخلوط از دست داده خواهد شد. این نکته بر اهمیت آزمایش هیستوگرام RBC و گسترش خونی به‌طور همزمان در جهت آشکارکردن جمعیت‌های bimodal تاکید می‌کند.

بتاتالاسمی ماژور (و ذرات کوچک دیگر)

در این حالت فرکانس بالایی از سلول‌های کوچک (کمتر از 50 فمتولیتر) در ابتدای هیستوگرام گلبول قرمز می‌تواند مشاهده شود (تصویر H-1). این مسئله ممکن است مربوط به ذرات کوچک که در این اختلال دیده می‌شود باشد مثل قطعات گلبول قرمز، RBCهای هسته‌دار، میکروسفروسیت‌ها و گلبول‌های میکروسیتیک که حجم سلولی متوسطی را به‌صورت غلط ایجاد می‌کند هرچند که منحنی unimodal به‌نظر می‌رسد. دستگاه آن را به‌عنوان دیمورفیک (احتمالا مربوط به مخلوطی از جمعیت‌های سلولی متفاوت) تفسیر می‌کند. هرگونه جمعیت سلولی کاذب و قلابی که بیشتر از 1%  RBCها باشد بر MCV و RDW و نتایج هیستوگرام تاثیر خواهد گذاشت. بنابراین در تمامی این مثال‌ها تنها با آزمایش دقیق هیستوگرام دانش علل احتمالی منحنی‌های آبنرمال و همبستگی دقیق با مورفولوژی خون محیطی میتوان به تشخیص صحیح دست یافت.

پیروپوئیکیلوسیتوز

پیروپوئیکیلوسیتوز ارثی (HPP) یک اختلال مادرزادی همولیتیک است که بوسیله‌ی آنمی همولیتیک متوسط تا شدید مشخص می‌شود (تصویر 1-L).ءHPP همچنین به‌عنوان یک فرم وخیم‌تر از الیپتوسیتوز ارثی در نظر گرفته می‌شود و علت آن یک نقص غشایی است که به‌وسیله‌ی افزایش حساسیت به لیز قطعه‌ای در 46 درجه سانتیگراد مطرح می‌شود. تصویر خونی شبیه به آن چیزی است که بعد از سوختگی‌های شدید دیده می‌شود. مانند تصویر 1-H، میکروسفروسیت‌ها، گلبول‌های قرمز هسته‌دار، فراگمنت‌های RBC، جوانه‌های غشایی و میکروالیپتوسیت‌ها در این وضعیت مشاهده می‌شوند. ممکن است یک کاهش متوسط در MCV و یک جهش بلند در هیستوگرام گلبول قرمز در قسمت چپ نشان بدهد. اگرچه RDW به‌صورت افزایش یافته باقی می‌ماند که مربوط به افزایش گوناگونی و تنوع حجم گلبول‌های قرمز است و نتیجه‌ی آن انحراف معیار (SD) بالا است.

محاسبه‌ی RDW-CV :SD تقسیم بر MCV

از آنجا که SD به‌صورت نامتناسبی افزایش یافته است با مقدار خیلی کم MCV ترکیب شده است، RDW به مقدار زیادی افزایش می‌یابد. هیستوگرام به‌وضوح شیفت به سمت چپ را نشان می‌دهد. نزدیک modal value در قسمت بالایی چپ گراف شروع می‌شود و در قسمت راست دور می‌شود و به آهستگی موجب متمایل شدن منحنی به سمت راست می‌گردد.

رتیکولوسیتوز

هیستوگرام bimodal و متمایل به راست است (تصویر 1-J). معمولا این ممکن است نوع تصویری باشد که بعد از درمان آنمی فقر آهن در ابتدا دیده می‌شود. 3 تا 8 روز پس از درمان موثر آهن یک رتیکولوسیتوز (پلی کرومازی) ممکن است واقع شود و یک پیک ثانوی که نشاندهنده‌ی این جمعیت سلولی جدید است ظاهر سازد. عموما رتیکولوسیت‌ها کمی بزرگتر از RBCهای نرمال بالغ هستند. شمارش رتیکولوسیت این بیمار 5/5 درصد است. بر طبق گفته‌ی برخی نویسندگان یک رتیکولوسیتوز افزون بر 15% و یا یک اختلاف حجم 2 جمعیت کمتر از 15% نیاز است که بر روی آنالیز هیستوگرام اثر بگذارد. اگرچه که برخی دیگر مطرح کرده‌اند که این امکان وجود دارد که تظاهر یک جمعیت جدید سلولی آشکار شود (مانند رتیکولوسیت‌ها) حتی در حالتی که بیشتر از 5% جمعیت کل RBCها با متمایل شدن هیستوگرام. بنابراین وابسته به الگوریتم دستگاه یک گروه از سلول‌ها حتی در 5% ممکن است به‌عنوان جمعیت دیگر تفسیر شود.

این 2 هیستوگرام گلبول قرمز (تصویر 1-K و 1-L) به نظر می‌رسد که مشابه هم باشند: هر دو دارای 2 نقطه‌ی اوج بلند به‌صورت ناصاف با یک شکاف میانی هستند. آنچه در این منحنی‌ها تعجب‌انگیز هستند اختلاف در نتایج RDW است. علی رغم هیستوگرام bimodal تصویر 1-K یک RDW نرمال نشان می‌دهد در مقایسه با تصویر 1-L که یک RDW بالاتری دارد. دلیل برای RDW نرمال آن است که تنها جمعیت‌های عمده شامل می‌شوند و اندازه‌گیری میشوند برای محاسبات MCV و RDW و بنابراین MCV و RDW تنها مربوط به جمعیت عمده هستند. شیار موج میانی که زیر 20% frequency truncation  است و جمعیت‌های مینور، همان‌طور که به‌وسیله‌ی یک پیک پائین (low peak) بیان میشود از محاسبات MCV و RDW کنار گذاشته شده‌اند.

واردکردن جمعیت‌های مینور همچنین لازم به گنجانیدن شیار میانی خواهد بود و بنابراین ممکن است به‌طور کاذب RDW را بالا ببرد. به‌عبارت دیگر به‎علت اینکه شکاف (دره) در تصویر 1-L از سطح آشکارسازی پیش افتاده جمعیت‌های مینور و ماژور در محاسبات RDW و MCV شامل شده‌اند. از این‌رو منجر به ارزش بالاتر RDW شده‌اند. به‌طور میکروسکوپیک هر دو یک جمعیت دوگانه از گلبول‌های قرمز هیپوکرومیک – میکروسیتیک و نورموکرومیک – نورموسیتیک نشان می‌دهند. تصویر 2-A  تا 2-F حاکی از هیستوگرام‌های مربوط به بعد از درمان آهن مربوط به 6 بیمار هستند.  هیستوگرام گلبول های قرمز در تائید تشخیص آنمی فقر آهن و همچنین پایش درمان آن کمک کننده است. بیماران با میکروسیتوزیس مربوط به آنمی فقر آهن معمولا یک منحنی فرکانس تک مودالی (unimodal) اما با درمان مناسب، در اکثریت موارد یک جمعیت دوم از سلول‌های نورموسیتیک ظاهر می‌شوند. تصویر 2-G نتایج اولیه را بعد از 3 روز درمان با آهن نشان می‌دهد. یک زیرگروه جمعیتی کوچکی از رتیکولوسیت‌ها وجود دارد که صرفا در انحراف به راست گراف سهیم هستند. در این مرحله MCV شروع به افزایش می‌کند و RDW بیشتر افزایش می‌یابد. بعد از 2 تا 4 هفته پس از درمان یک جمعیت مجزا و مشخص از سلول‌های نورموسیتیک تازه پدیدار شده با مقداری پلی کرومازی بر روی گراف و نیز در گسترش خونی نمایان می‌شود، اگرچه یک پیک ثانوی نیز بلافاصله شروع می‌شود تا شکلی نظیر تصویر 2-F را نشان دهد. تصویر 2-E دو پیک جمعیتی مشخص نابرابر از سلول‌های میکروستیک و نورموسیتیک را نشان می‌دهد و بدین معنی است که بیش از 15% کل جمعیت سلولی را سلول‌های نورموسیتیک تشکیل می‌دهند و باقیمانده مربوط به سلول‌های میکروسیتیک هستند. 5 تا 6 هفته بعد، تصویر 2-D دو پیک قرینه نشان می‌دهد که بیانگر تعداد تقریبا برابر سلول‌های هیپوکرومیک میکروسیتیک و نورموکرومیک نورموسیتیک است. 7 و تا 15 هفته بعد (105روز) سلول‌های نورموسیتیک سلول‌های غالب را تشکیل می‌دهند و همانطور که در تصویر 2-C و 2-B دیده می‌شود هیستوگرام شروع می‌کند که به سمت چپ تمایل پیدا کند. بعد از 17 هفته (120روز) پس از درمان موثر همانطور که در تصویر 2-A مشاهده می‌شود یک جمعیتی از سلول‌های عمدتا نورموسیتیک نورموکرومیک و یک MCV و RDW نرمال پدید خواهد آمد. به استثنای هرگونه کمپلیکاسیون یا وجود همزمان نقص ویتامین B12 و فولات، بنظر می‌رسد که هیستوگرام‌ها و یا MCV در مراحل مختلف بعد از درمان آهن ممکن است فرق کنند اگرچه طرح تغییرات اندازه‌ی گلبول قرمز از رتیکولوسیتوز اولیه تا به‌تدریج نورموسیتوزیس به همان صورت ظاهر می‌شود.

نتیجه‌گیری

هنگام ارزیابی یک هیستوگرام گلبول قرمز، طرح کلی آن باید مورد بررسی قرار گیرد. هیستوگرام بر اساس شکل، مرکز و طرز گسترش آن توصیف می‌شود. طرح هیستوگرام بدون مقایسه با یک هیستوگرام رفرانس یا بدون تائید توسط میکروسکوپ بی‌معنی است. برخی توزیع‌ها اشکال ساده‌ای دارند مثل اشکال قرینه و متمایل شده به جهتی اما برخی دیگر دارای چالش بیشتری هستند به‌ویژه موقعی‌که جمعیت‌های دوگانه (multiple) از گلبول های قرمز حضور دارند. با توجه به اینکه دایمورفیک و dual population هم معنی و مترادف یکدیگرند و ممکن است هنگام گزارش موجب اغتشاش و در هم برهمی نتایج شوند شناسایی کامل دیمورفیک به‌عنوان بیش از دو جمعیت سلولی دارای اهمیت کاربردی (practical) و کلینیکال هستند. از نظر کلینیکی همان‌طور که در جدول شماره 1 نشان داده شده با وضعیت‌های بسیاری مرتبط است. از نظر عملی، از آنجا که دیمورفیک معمولا مرتبط است با جمعیت‌های آبنرمال RBCها، یافته‌های مورفولوژیک باید با داده‌های عددی و گرافیکی برای تفسیر بهتر نتایج ارتباط داده شوند. اگرچه بررسی مستقیم منحنی توزیع برای آشکارکردن جمعیت‌های کوچک RBCهای میکروسیتیک یا ماکروسیتیک یک روش حساس را ارائه می‌کند از تخمین تعداد سلول‌ها از روی منحنی توزیع باید اجتناب نمود. نتایج گمراه‌کننده بدلیل اینکه فرکانس منحنی تنها تعداد نسبی سلول‌ها را نشان می‌دهد نه تعداد واقعی آن‌ها در اندازه‌های مختلف، می‌تواند اتفاق بیافتد. اگرچه MCV در هر منحنی توزیع قرینه به آسانی قرار می‌گیرد اما در مورد منحنی‌های متمایل شده به سمتی، یا منحنی‌های bimodal و یا جمعیت‌های دیمورفیک نتایج خوبی ندارد زیرا MCV ارزش متوسط است و منعکس‌کننده‌ی هتروژنیتی یا حضور جمعیت‌های سلولی مختلف نیست.

در ترکیب با مفهوم منحنی نرمال و اطلاع از پارامترهای خاصی از CBC مثل RDW و اندکس‌های گلبول قرمز هیستوگرام‌ها در مرحله‌ی ابتدایی آنالیز مورفولوژیکی به‌صورت یک ابزار کاری عملی درمی‌آیند. مشاهده‌ی شکل اجمالی آن‌ها ممکن است آنقدر آشکار و بدیهی باشد که حضور فراگمنت‌ها، گلبول های قرمز هیپوکرومیک میکروسیتیک، ماکروسیتیک یا دیمورفیک‌ها و نیز ترکیب‌های مختلف آن‌ها با هم می‌توانند فرض شوند. به‌علاوه هیستوگرام یک ایده‌ی مختصر را نه تنها در اندازه‌های مختلف سلول بلکه توزیع سلول‌ها از مرکز (MCV) و گسترش آن (RDW) را فراهم می‌کند. به هر کدام از مکانیسم‌هایی که در روش‌های دستگاهی مورد استفاده قرار می‌گیرد یعنی ایمپدانس الکتریکی یا فلوسیتومتری اپتیکال، ارتباط اندازه‌های مختلف سلول‌ها و نیز مغایرت (هم‌سنجی) آن‌ها می‌تواند به آسانی مورد بررسی قرار گیرد به‌ویژه موقعی‌که نقطه خط (dotted line) از مقادیر نرمال رفرانس بر روی تمامی هیستوگرام‌های آبنرمال گلبول قرمز اضافه شده باشد. از مرورکردن هیستوگرام‌ها میتوان به ایده‌ی خوبی رسید که هنگامی‌که ارزیابی واقعی بر روی گسترش خونی صورت می‌گیرد چه چیز مورد انتظار است. متاسفانه اکثر تکنولوژیست‌ها برای ارتباط دادن تصاویر گرافیکی با یافته‌های مورفولوژیک تجربه‌ی خوبی ندارند.  احتمالا به این علت است که  بیان نتایج گرافیکی مثل نمودار پراکندگی (scatter plots) یا هیستوگرام‌ها برای RDW، پهنای توزیع هموگلوبین (HDW) و محتوای هموگلوبینی رتیکولوسیت به مقدار زیادی مورد غفلت قرار می‌گیرند در حالیکه به همراه اندکس‌های گلبول قرمز اطلاعات بسیار مفیدی را فراهم می‌کنند. در حقیقت در برخی آزمایشگاه‌ها هنگام ارزیابی مورفولوژی RBC از هیستوگرام ها استفاده نمی‌شود. علاوه‌بر این مطالعات خیلی کمی وجود دارد که سودمندی هیستوگرام های گلبول قرمز را در شناسایی اختلالات شایع هماتولوژیکی نشان دهد. بیشتر مطالعات متوجه هیستوگرام های گلبول های سفید و استفاده از آن‌ها در شناسایی و مشخص‌کردن جمعیت‌های بلاست لوکمیک می‌باشند. امید است که آنالیز و تفسیرهای هیستوگرام ها در این نوشتار یک راهنمای خوب برای ارتباط‌دادن هیستوگرام‌ها با یافته‌های میکروسکپی باشد. سرعت و اعتمادپذیری آنالیزرهای مدرن به تکنولوژیست‌ها این اجازه را می‌دهد که به کمک کلیدهای تشخیصی لام‌های خونی آبنرمال را ارزیابی نموده و یافته‌های کلینیکال را به هیستوگرام‌ها و سایر پارامترهای هماتولوژیکی با اطمینان (confidence) و اثر بخشی (efficiency) بیشتری ارتباط دهند و تمام اینها در جهت ارتقاء مراقبت از سلامت بیمار می‌باشد.

اختلاف های بین باکتری های گرم مثبت و باکتری های گرم منفی

هماتولوژی: مروری بر اختلالات سیستم لنفوپرولیفراتیو

اثرات فیزیولوژیک اریتروسیتوز

تست اکسیداز

اریتروسیتوز