BCYE آگار: ترکیبات و نتایج، موارد استفاده

آگار عصاره مخمر زغال سنگ بافر (Buffered Charcoal Yeast Extract Agar) که با نام اختصاری BCYE  آگار شناخته می‌شود یکی از محیط کشت‌های پرکاربرد برای بررسی گونه‌های لژیونلا^[1] است. لژیونلا یک جنس از باکتری‌های گرم منفی بیماری‌زا است که باعث نوعی ذات الریه به نام بیماری لژیونر و یک بیماری خفیف شبیه آنفولانزا به نام تب پونتیاک می‌شود.

برای اطلاعات بیشتر در مورد لژیونلا می‌توانید به مقاله ” لژیونلا، عفونتی خطرناک در آب آشامیدنی” مراجعه کنید. اما در این مطلب قصد داریم به بررسی BCYE  آگار، نحوه آماده‌سازی آن و نتایج حاصل از کشت میکروارگانیسم‌ها روی این محیط کشت بپردازیم.                                                              

مروری اجمالی بر تاریخچه BCYE  آگار

در سال 1978 دانشمندان محیطی را برای جداسازی گونه لژیونلا ایجاد کردند. در ابتدا این محیط کشت حاوی هیدرولیز کازئین (casein hydrolysate)، عصاره گوشت گاو (beef extract) و نشاسته بود. اما بعدها هیدرولیز کازئین و عصاره گوشت گاو با عصاره مخمر جایگزین گردید و به‌جای نشاسته نیز از ذغال چوب استفاده شد. بدین ترتیب محیط کشت اولیه اصلاح شد. محققین این محیط کشت جدید و اصلاح شده را  CYE آگار (عصاره مخمر زغال سنگ) نامیدند.

در سال 1980 اصلاح دیگری در ترکیبات این محیط کشت صورت گرفت. به منظور حفظ pH مناسب برای رشد بهینه میکروارگانیسم‌ها، بافر ای‌سی‌ای‌اس (ACES buffer) به ترکیب این محیط کشت اضافه گردید. در نهایت محیط کشت به عنوان BCYE آگار شناخته شد.

محققین بعدها و در سال 1981 با افزودن نمک پتاسیم آلفا کتوگلوتاریک اسید^[2]،  حساسیت BCYE  آگار را افزایش دادند.

اصول BCYE  آگار

BCYE  آگار یک محیط کشت پایه است که برای جداسازی لژیونلا از نمونه‌های بالینی و محیطی استفاده می‌شود.

گونه‌های لژیونلا باکتری‌های میله‌های شکل و گرم منفی غیر اسپورساز هستند که باعث ذات‌الریه (بیماری لژیونر) یا تب پونتیاک می‌شوند. این باکتری‌ها در محیط‌های معمولی کربوهیدرات‌ها را اکسید یا تخمیر نمی‌کنند و در آگار خون گوسفند نیز رشدی ندارند.

به همین دلیل برای کشت آن‌ها از آگار عصاره مخمر زغال سنگ بافر استفاده می‌شود.

BCYE  آگار شامل اجزای مختلفی است که به جداسازی و رشد گونه‌های لژیونلا کمک می‌کند. اسید آمینه L-cystine نقش مهمی در متابولیسم رشد لژیونلا دارد. این اسید آمینه همراه با پیروفسفات آهن به رشد لژیونلا کمک می‌کند.

از طرف دیگر BCYE  آگار ، حاوی ذغال چوب است که به عنوان سم‌زدا عمل می‌کند. این ماده  پراکسید هیدروژن، که محصول متابولیکی سمی برای گونه‌های لژیونلا است، را تجزیه می‌کند.

 عصاره مخمر موجود در  BCYE  آگار نیز به عنوان یک منبع غنی از ویتامین‌ها، نیتروژن و همچنین کربن لازم برای حمایت از رشد میکروارگانیسم عمل می‌کند.

بافر، pH مطلوب را برای رشد لژیونلا را حفظ می‌کند.

ال سیستئین (L-cystine)، پیروفسفات آهن (Ferric Pyrophosphate) و آلفا کتوگلوتارات (alpha-ketoglutarate) با تحریک آنزیم های مهارکننده اکسیژن، سبب رشد گونه‌های لژیونلا می‌شوند.

ترکیبات BCYE  آگار

همانطور که در قسمت قبل گفته شد، ترکیبات BCYE  آگار به مرور زمان تغییر یافت واصلاح شد. در جدول 1 به بررسی ترکیبات عصاره مخمر زغال سنگ بافر خواهیم پرداخت که امروزه در آزمایشگاه‌های سراسر دنیا مورد استفاده قرار می‌گیرد.

آماده سازی BCYE  آگار

• جهت آماده سازی BCYE آگار ابتدا بافر ACES را به 940 میلی لیتر آب مقطر اضافه کنید و در حمام آب 50 درجه سانتیگراد قرار دهید تا حل شود.
• حدود 40 میلی لیتر پتاسیم هیدروکسید ^[3]( 1نرمالیته) به محلول بافر اضافه کنید تا pH آن به 6.9 برسد.  توجه داشته باشید که از NaOH استفاده نکنید زیرا بر اساس بررسی‌های صورت گرفته، این ماده مهارکننده لژیونلا پنوموفیلا است و از رشد آن در محیط کشت جلوگیری می‌کند.
• ذغال چوب، عصاره مخمر، آلفا کتو گلوتارات و آگار را درون یک ارلن با یکدیگر ترکیب کنید. سپس محلول بافر که در مرحله قبل آماده شده بود را به آن اضافه کنید.
• مواد را با احتیاط روی هات پلیت آزمایشگاهی قرار دهید تا آگار حل شود. سپس محلول را به کمک اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه استریل کنید.
• پس از گذشت 15 دقیقه، محیط کشت را بلافاصله در حمام آب 50 درجه سانتیگراد قرار دهید.
• محلول ال سیستئین فیلتر شده را به BCYE آگار اضافه کرده و کاملاً مخلوط کنید.
• پیروفسفات آهن محلول فیلتر شده را نیزاضافه کرده و کاملاً مخلوط کنید. توجه داشته باشید که آهن و سیستئین باید به صورت جداگانه به محلول اضافه شوند. بنابراین این دو ماده را قبل از افزودن به محیط کشت با یکدیگر مخلوط نکنید.
• pH محیط را در دمای اتاق روی 6/9 تنظیم کنید. برای این کار می‌توانید از HCl یا KOH استفاده کنید.
• BCYE آگار را درون پتری‌دیش‌ها بریزید. هر پتری دیش 15 × 100 میلی‌متری باید حدودا حاوی 20 میلی‌لیتر از محیط کشت باشد.
• پس از اینکه BCYE آگار جامد شد، پتری‌دیش‌ها را درون کیسه‌های پلاستیکی قرار داده و در یخچال، در تاریکی نگهداری کنید. در چنین شرایطی می‌توان محیط کشت را حدود 4 ماه نگهداری کرد.

کنترل کیفیت BCYE  آگار

هربار که محیط کشت  BCYE  آگار را آماده می‌کنید، باید آن‌را از لحاظ  pH و توانایی حمایت از رشد گونه‌های لژیونلا بررسی کنید.

pH محیط کشت BCYE  آگار، باید 0/05 ± 6/9  باشد. برای بررسی این موضوع، از یک pH متر استفاده کنید. اگر مقدار زیادی از محیط کشت با محدوده pH قابل قبول مطابقت ندارند، pH محیط را با اضافه کردن 1/0 نرمالیته از KOH یا HCl تنظیم کنید.

جهت بررسی توانایی محیط کشت برای رشد گونه‌های لژوینلا ابتدایک کشت استوک تهیه کنید. به این منظور نمونه‌ای از L. pneumophila (در فاز log) را در آب مقطر استریل تلقیح کنید. (به غلظت10cells/mL   )

سپس 0/05  میلی لیتر از استوک را با استفاده از تکنیک کشت خطی، در BCYE  آگار تلقیح کنید. پلیت‌ها را در دمای 35 درجه سانتی گراد و با شرایط  2/5 درصد  CO2 انکوبه کنید.

محیط کشت را روزانه بررسی کنید. رشد باید بعد از یک روز در ناحیه‌ی تلقیح شده اتفاق بیفتد. کلنی‌های ایزوله باید در عرض 2 تا 3 روز از نظر ماکروسکوپی قابل مشاهده باشند. البته اگر سلول‌های مورد استفاده در استوک، در یخچال یا فریزر قرار گرفته باشند، رشد کندتر خواهد بود.

در صورت امکان، BCYE  آگار باید با استفاده از یک نمونه آب محیطی حاوی غلظت شناخته شده‌ای از لژیونلا و سایر باکتری‌ها نیز بررسی شود.

تفسیر نتایج کشت نمونه در BCYE  آگار

در بین گونه‌های لژیونلا، لژیونلا پنوموفیلا (Legionella pneumophila ) بیشترین میزان بیماری‌زایی را در انسان دارد. چنانچه این باکتری در نمونه‌های بالینی یا محیطی وجود داشته باشد، کلنی‌های صاف و بی‌رنگ را در BCYE  آگار تشکیل می‌دهد. برخی اوقات ممکن است این کلنی‌ها به رنگ آبی بسیار کم‌رنگ و مایل به خاکستری دیده شوند. کلنی‌های لژیونلا پنوموفیلا در BCYE  آگار کمی مخاطی هستند و با افزایش سن (هرچه مدت بیشتری از کشت آن‌ها بگذرد) سفیدتر و رشته‌ای‌تر می‌شوند. این کلنی‌ها زیر نور فرابنفش موج بلند به رنگ زرد یا سبز فلورسانس دیده می‌شوند.

سطح کلنی لژیونلا پنوموفیلا در BCYE  آگار، عموماً صاف است، اما برخی از گونه‌ها ممکن است ظاهری به شکل تخم‌مرغ سرخ‌شده ایجاد کنند.

نکاتی برای استفاده از BCYE آگار

توصیه می‌شود برای شناسایی کامل گونه‌های لژونلا، آزمایش بیوشیمیایی، ایمونولوژیک، مولکولی یا طیف سنجی جرمی نیز در کنار BCYE آگار روی کلنی‌های حاصل از کشت خالص انجام شود.

همچنین توصیه می‌شود از بیش از یک نوع محیط کشت برای جداسازی گونه‌های لژیونلا استفاده شود. به این ترتیب که پلیت‌های حاوی آگار غیرانتخابی و انتخابی BCYE آگار به صورت موازی تلقیح شوند.

توجه داشته باشید که به دلیل تنوع غذایی، برخی از سویه‌های لژونلا ممکن است با رشد ضعیفی مواجه شوند یا در BCYE آگار رشد نکنند.

کلنی‌های لژیونلا که روی فیلترهای غشایی سفید ایجاد می‌شوند ممکن است ظاهر متفاوتی با کلنی‌هایی داشته باشند که در پس زمینه سیاه یا تیره ایجاد می‌شوند.

هنگام کشت گونه‌های لژیونلا در BCYE ، مهم است که از تشکیل آئروسل جلوگیری کنید.

واژه نامه