فرآیند تولید ویتامین B12 (کوبالامین): از میکروب تا مکمل غذایی
ویتامین B12 یا کوبالامین یکی از ویتامین‌های ضروری و محلول در آب است که نقش حیاتی در متابولیسم سلولی، تشکیل گلبول‌های قرمز و حفظ عملکرد سیستم عصبی دارد. کمبود این ویتامین می‌تواند منجر به مشکلات جدی از جمله کم‌خونی پرنیشیوز، ضعف، خستگی و اختلالات عصبی شود. از آنجا که بدن انسان قادر به سنتز ویتامین B12 نیست، دریافت آن از منابع غذایی یا مکمل‌ها ضروری است. فرآیند تولید ویتامین B12 معمولاً به کمک میکروارگانیسم‌ها انجام میشود. زیرا تنها برخی از باکتری‌ها و اکتینومیست‌ها توانایی سنتز آن را دارند. به همین دلیل، تولید صنعتی ویتامین B12 به یکی از موضوعات مهم در حوزه بیوتکنولوژی صنعتی تبدیل شده است. در این مقاله، به معرفی میکروارگانیسم‌های تولیدکننده ویتامین B12، روش‌های کشت و فرآیندهای صنعتی تولید آن پرداخته میشود. همچنین ساختار شیمیایی و اشکال مختلف این ویتامین بررسی شده و اهمیت آن در تغذیه و کاربردهای درمانی مورد بحث قرار می‌گیرد.
مروری کلی بر فرآیند تولید ویتامین B12
ویتامین B12 یا کوبالامین یک ویتامین محلول در آب است که نقش حیاتی در رشد طبیعی انسان و حیوانات ایفا می‌کند. اهمیت این ویتامین زمانی آشکار شد که در سال 1948، Ricke E. L. و Smith L. موفق شدند مقدار اندکی از ماده فعال را از کبد استخراج و آن را به شکل کریستالی خالص، تحت عنوان ویتامین B12، جداسازی کنند. این کشف بزرگ، نقطه عطفی در تاریخ پزشکی بود، چراکه این ترکیب توانست در درمان کم‌خونی پرنیشیوز (Pernicious Anemia) مورد استفاده قرار گیرد.
ویتامین B12 از نظر ساختاری یکی از بزرگ‌ترین و پیچیده‌ترین مولکول‌ها در میان ویتامین‌ها به شمار می‌رود. بخش اصلی این مولکول شامل یک حلقه پورفیرین (Porphyrin Ring) است که عنصر کبالت (Cobalt) در مرکز آن قرار دارد. به همین دلیل، فرآیند تولید ویتامین B12 در طبیعت و صنعت نیازمند شرایط ویژه‌ای است.
بسته به گروه‌های شیمیایی متصل به کبالت، اشکال مختلفی از این ویتامین شکل می‌گیرند:
- اتصال گروه سیانید (CN-) منجر به تشکیل سیانوکوبالامین (Cyanocobalamin – ویتامین B12) میشود.
- اتصال گروه هیدروکسیل (-OH) باعث ایجاد هیدروکوبالامین (Hydroxocobalamin) می‌گردد.
- و اتصال گروه نیتریت (-NO2)، ترکیب نیتریت‌کوبالامین (Nitritocobalamin) را به وجود می‌آورد.
ساختار شیمیایی ویتامین B12 در شکل زیر نمایش داده شده است.
کدام میکروارگانیسم‌ها قادر به تولید ویتامین B12 هستند؟
ویتامین B12 به وسیله برخی باکتری‌ها و اکتینومیست‌ها (Actinomycetes) ساخته میشود. از میان آن‌ها، گونه‌هایی زیر بیشتر برای تولید صنعتی ویتامین B12 استفاده می‌شوند.
- Streptomyces olivaceus
- Pseudomonas denitrificans
- Propionibacterium shermanii
- Propionibacterium freudenreichii
به طور معمول، تولید ویتامین B12 با روش کشت غوطه‌ور (Submerged Culture) انجام می‌گیرد. در ادامه، روند تولید این ویتامین توسط Streptomyces olivaceus توضیح داده شده است.
گونه‌های میکروارگانیسم دخلی در فرایند تولید ویتامین B12
در جدول زیر گونه های اصلی دخیل در تولید ویتامین B12 بیان شده است.
| گروه میکروارگانیسم | گونه‌ها |
| اکتینومیست‌ها (Actinomycetes) | Streptomyces olivaceus, Nocardia species, Streptomyces albidoflavus, S. antibioticus, S. aureofacieus, S. griseus, S. roseochromogenus |
| باکتری‌ها (Bacteria) | Pseudomonas denitrificans, Aerobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Propionibacterium shermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium butyricum, Flavobacterium acetylicum, Flavobacterium flavescens, Lactobacillus arabinosus, Mycobacterium smegmatis, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Streptococcus faecalis |
مراحل تولید ویتامین B12
در ادامه روند تویلد این ویتامین در آزمایشگاه شرح داده شده است.
آماده‌سازی اینوکولوم (Inoculum)
برای تولید ویتامین B12، ابتدا یک کشت خالص از Streptomyces olivaceus در محیط اینوکولوم داخل ارلن مایرها تلقیح میشود. برای رشد اینوکولوم، از محیط کشت Bennett’s broth استفاده میشود که شامل عصاره مخمر (0.1%)، عصاره گوشت (0.1%)، گلوکز (1) و هیدرولیز آنزیمی کازئین ( (%0.25) است.
اینوکولوم به مقدار مشخصی از میکروارگانیسم زنده (مثل باکتری، قارچ یا مخمر) گفته میشود که به یک محیط کشت تازه یا محیط تولید انتقال داده میشود تا رشد کند و ماده مورد نظر (مثلاً ویتامین B12، آنتی‌بیوتیک یا آنزیم) را تولید کند.
در واقع اینوکولوم همون “بذر میکروبی” هست که برای شروع فرآیند تخمیر یا کشت میکروبی استفاده میشود.
ارلن مایرها طی دوره انکوباسیون روی شیکر قرار می‌گیرند تا تهویه و هوادهی مناسبی فراهم شود. سپس این کشت‌ها برای تلقیح حجم بیشتری از محیط اینوکولوم استفاده می‌شوند. مقدار مورد نیاز اینوکولوم، معادل ۵٪ از حجم محیط تولید، از طریق انتقال‌های متوالی (successive transfers) آماده میشود.
تخمیر (Fermentation)
مرحله دوم از فرایند تولید ویتامین B12 تخمیر است. کشت Streptomyces olivaceus در یک محیط خام غنی از مواد مغذی و با تهویه مناسب در دمای ۲۸ درجه سانتی‌گراد رشد می‌کند. در محیط تولید استاندارد ویتامین B12 معمولاً ترکیباتی مانند Distiller’s soluble (4%)، دکستروز (1%) و کربنات کلسیم(%0.5) وجود دارد. همچنین، کلرور کبالت (Cobalt chloride, CoCl₂·6H₂O) به میزان تقریبی ۲ تا ۱۰ ppm به محیط اضافه میشود تا به عنوان پیش‌ساز (precursor) در تولید ویتامین B12 عمل کند.
پیش از استریل‌سازی، pH محیط بین ۷ تا ۷.۵ تنظیم میشود و ممکن است در طول فرآیند تخمیر کنترل شود یا نشود.در ۲۴ ساعت اول تخمیر، pH به دلیل مصرف سریع قند کاهش می‌یابد و پس از ۴۸ تا ۹۶ ساعت، pH مجدداً افزایش می‌یابد که ناشی از لیز (Lysis) میسلیوم است.
برای رشد مناسب سویه‌های میکروبی، سرعت تهویه و میزان اختلاط (agitation) باید به درستی تنظیم شود. نرخ تهویه بهینه حدود ۰.۵ حجم هوا به ازای هر حجم محیط در دقیقه است. همچنین از روغن سویا، روغن ذرت، روغن خوک و سایر روغن‌ها به عنوان ضدکف (antifoaming agents) استفاده میشود تا تشکیل کف در طول تخمیر کنترل شود.
بازیابی ویتامین (Recovery of Vitamin B12)
1- ارتباط ویتامین B12 با میسلیوم
وقتی Streptomyces olivaceus یا گونه‌های مشابه پرورش داده می‌شن، بخش عمده‌ای از ویتامین B12 (کوبالامین) درون میسلیوم‌ها (رشته‌های قارچی‌مانند باکتری) تجمع پیدا می‌کند.یعنی ویتامین به‌طور کامل در محیط کشت آزاد نمی‌شود، بلکه به سلول‌ها و توده میسلیومی متصل باقی می ماند.
بنابراین برای به‌دست آوردن ویتامین، باید ابتدا میسلیوم رو از محیط جدا کنیم.
2- جداسازی میسلیوم از محیط
معمولاً بعد از ۳ تا ۴ روز تخمیر، محلول یا اصطلاحاً beer (محیط کشت تخمیری) آماده برداشت میشود.
برای جداسازی از سانتریفیوژ استفاده می‌کنند تا میسلیوم ته‌نشین شود.می‌توان از فیلتراسیون نیز استفاده کرد تا تا ذرات سلولی از محیط جدا شوند.
در این مرحله بخش زیادی از ویتامین همراه با میسلیوم جدا شده باقی می‌ماند.
3- افزایش غلظت و پایداری در تولید ویتامین B12
برای اینکه ویتامین B12 تغلیظ شود لازم است تا:
pH محلول با استفاده از اسید سولفوریک (H₂SO₄) به حدود ۵ برسد.
سپس محیط حرارت داده میشود تا به نقطه جوش برسد. این کار باعث آزاد شدن بیشتر ویتامین از سلول‌ها و تثبیت آن میشود.
ویتامین B12 حساس است. برای جلوگیری از تخریب آن، حدود ۱۰۰ ppm سدیم سولفیت (Na₂SO₃) به محیط اضافه میشود این ماده نقش آنتی‌اکسیدان و محافظ را دارد.
4- تبدیل کوبالامین به فرم پایدارتر
بعد از جدا کردن میسلیوم، محلول فیلتری به دست می‌آید. به این محلول سایانید (CN⁻) اضافه می‌کنند تا کوبالامین به شکل پایدارتر یعنی سیانوکوبالامین (Cyanocobalamin) تبدیل شود.
دلیل آن این است که سیانوکوبالامین مقاوم‌تر، پایدارتر و راحت‌تر برای جداسازی و ذخیره‌سازی است.
5- جذب و جداسازی سیانوکوبالامین
در این مرحله باید ویتامین از محیط جدا شود. برای این کار از مواد جاذب از جمله موارد زیر استفاده میشود:
- زغال فعال (Activated charcoal)
- خاک فولر (Fuller’s earth)
- بنتونیت (Bentonite)
این مواد مثل یک اسفنج عمل کرده و سیانوکوبالامین را از محیط جذب می‌کنند.
6- الوشن (Elution) یا آزادسازی ویتامین
وقتی ویتامین روی جاذب‌ها نشست، باید دوباره از آن‌ها جدا شود.این کار با شستن (Elution) توسط محلول‌های خاص مانند موارد زیر صورت می‌گیرد:
- محلول‌های آبی شامل بازهای آلی (Organic bases)
- اسید هیدروکلریک (HCl) رقیق.
7- روش‌های استخراج (Extraction)
برای خالص‌سازی بیشتر:
یا از استخراج یک‌مرحله‌ای با حلال‌های آلی استفاده میشود.
یا از استخراج جریان مخالف (Counter-current extraction) که روشی صنعتی و کارآمدتر است استفاده میشود.
سپس ویتامین طی فرآیند رسوب‌گیری (Precipitation) خالص‌تر میشود.
8- خالص‌سازی نهایی
در مرحله آخر برای رسیدن به خلوص دارویی یا غذایی از کروماتوگرافی روی آلومینا (Al₂O₃) استفاده میشود.
سپس ویتامین طی فرآیند کریستالیزاسیون از مخلوط اتانول–استون به صورت کریستال خالص در می‌آید.
9- خشک‌کردن و محصول نهایی
کریستال‌های ویتامین باید به شکل پودر خشک در بیاید تا قابل بسته‌بندی و استفاده شود.
برای این منظور دو روش اصلی وجود دارد:
- خشک کردن درام (Drum-drying): در این روش محلول غلیظ محصول روی سطح داغ درام‌های چرخان پخش شده و در اثر تماس با سطح گرم، لایه نازکی از ماده خشک‌شده به‌سرعت تشکیل و جدا میشود.
- اسپری‌درایینگ (Spray-drying): در این روش محلول محصول به صورت قطرات ریز در یک جریان هوای داغ پاشیده میشود و در نتیجه خشک‌کردن سریع، پودر ریز و یکنواخت حاصل می‌گردد.
محصول نهایی معمولاً ۱۰ تا ۳۰ میلی‌گرم ویتامین B12 در هر لیتر محیط تخمیری دارد.
سخن پایانی
ویتامین B12 یا کوبالامین یک ویتامین حیاتی و محلول در آب است که نقش مهمی در سلامت انسان و حیوانات دارد، به ویژه در متابولیسم سلولی، تولید گلبول‌های قرمز و عملکرد سیستم عصبی. از آنجا که بدن انسان قادر به سنتز این ویتامین نیست، تولید ویتامین B12 در مقیاس صنعتی اهمیت فراوانی پیدا کرده است.
در این مقاله، فرآیند تولید ویتامین B12 از Streptomyces olivaceus مورد بررسی قرار گرفت. مراحل اصلی شامل آماده‌سازی اینوکولوم، تخمیر در محیط غنی با تهویه مناسب، و بازیابی و خالص‌سازی ویتامین بود. استفاده از شرایط کنترل‌شده مانند pH، تهویه، سرعت اختلاط و افزودن عوامل ضدکف، نقش کلیدی در افزایش بازدهی و کیفیت محصول نهایی دارد.
