آزمایش‌ها و آزمایشگاه صنایع غذایی (میکروبیولوژی)

تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis در محصولات گیاهی تازه

1 آبان 1404

فهرست محتوا نمایش

سیکلوسپورا کایتاننسیس ( Cyclospora cayetanensis ) انگل تک‌یاخته‌ای از گروه کوکسیدیا است که باعث بیماری سیکلوسپوریازیس (Cyclosporiasis) در انسان می‌شود. این انگل بیشتر از طریق مصرف آب و غذاهای آلوده (به‌ویژه سبزیجات و میوه‌های خام شسته‌نشده) منتقل می‌شود. عفونت ناشی از آن بیشتر در مناطق گرمسیری و نیمه‌گرمسیری شایع است و معمولاً با علائمی مانند اسهال آبکی، نفخ، تهوع، درد شکمی و خستگی طولانی‌مدت همراه است. چرخه زندگی این انگل در روده انسان کامل می‌شود و اووسیت‌های دفع‌شده از بدن، پس از چند روز در محیط خارجی بالغ و آلوده‌کننده می‌شوند. جهت جلوگیری از انتشار این بیماری، شناسایی این انگل از اهمیت بالایی برخوردار است. در مقاله حاضر روش استاندارد تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس را از طریق ^[1]Real time PCR مورد بررسی قرار می‌دهیم.

1.روش استاندارد تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis در محصولات تازه با استفاده از Real time PCR

این روش تحلیلی شامل مراحلی برای جداسازی اووسیست‌های Cyclospora cayetanensis از محصولات تازه می‌باشد. مراحل انجام آن شامل شست‌وشو و سپس آماده‌سازی الگوی DNA از محلول‌های شست‌وشوی محصول است. این عملیات در نهایت منجر به تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس خواهد شد.

1.1. تجهیزات آزمایشگاهی جهت تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

گاهی وجود آلودگی باعث ایجاد نتایج مثبت کاذب خواهد شد. برای جلوگیری از آن لازم است تمامی مراحل تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس اعم از مراحل شستشوی نمونه‌‌ها، استخراج DNA و Real Time PCR در بخش‌هایی انجام شوند که از هم جدا باشند.

برای کاهش احتمال آلودگی، توصیه می‌شود مراحل تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس در نواحی زیر انجام گیرند:
الف) یک میز آزمایشگاهی برای شست‌وشوی محصول
ب) یک هود برای انجام فرآیند استخراج DNA

2.1. مواد و تجهیزات تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس

کیسه‌های فیلتردار Interscience BagPage®+ با حجم ۴۰۰ میلی‌لیتر، بسته ۵۰۰ عددی، شماره کاتالوگ EW-36840-56 (ColeParmer)
گیره‌های کیسه Interscience، بسته ۵۰ عددی، شماره کاتالوگ EW-36850-46 (Cole-Parmer)
پیپت‌های سرولوژیک یک‌بار مصرف، ۵ میلی‌لیتر و ۲۵ یا ۵۰ میلی‌لیتر
سینی برای نگهداری کیسه‌های فیلتردار در هنگام شست‌وشو (مطابق تصاویر 2 و 3)
دستگاه Stovall Belly Dancer یا هر پلتفرم مشابه با حرکت چرخشی برای اختلاط
دستگاه راکر شیکر (Platform rocker)
لوله‌های سانتریفیوژ مخروطی ۱۵ و ۵۰ میلی‌لیتری برای شست‌وشوی محصول
سانتریفیوژ یخچال‌دار Sorvall Legend RT+ یا معادل آن (برای سانتریفیوژ کردن لوله‌های مخروطی ۱۵ و ۵۰ میلی‌لیتری)
فلاسک خلأ ۲ لیتری (یا بزرگ‌تر) متصل به پمپ خلأ آزمایشگاه
پیپت‌ پاستور‌های شیشه‌ای کوتاه برای برداشت محلول‌های شست‌وشو تحت خلأ
لوله‌های خالی FastPrep® با حجم ۲ میلی‌لیتر و درپوش، شماره کاتالوگ 115076400 و 115064002 (MP Biomedicals)
لوله‌های میکروسانتریفیوژ ۲.۰ میلی‌لیتری فاقد DNase
دستگاه FastPrep®-24 (MP Biomedicals) یا هموژنایزر مشابه
لوله‌های سانتریفیوژ مخروطی ۱۵ میلی‌لیتری برای مرحله اتصال DNA
سانتریفیوژ رومیزی مناسب لوله‌های ۲.۰ میلی‌لیتری
میکروپیپت‌ها
سرپیپت‌های مقاوم در برابر آئروسل(Aerosol)
دستکش لاتکس یا نیتریل
دستگاه ورتکس میکسر

3.1. مواد شیمیایی (واکنش‌گرها) تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

الف) پودر شوینده شیشه‌آلات آزمایشگاهی Alconox®، شماره قطعه EW-17775-0 (ColeParmer)
۱. محلول استوک ۱.۰٪ Alconox
۲. محلول شست‌وشوی محصول ۰.۱٪ Alconox

ب) کیت FastDNA® SPIN مخصوص خاک، شماره قطعه 6560-200 (MP Biomedicals)

ج) اتانول ۱۰۰٪ برای فرآیند استخراج DNA

د) آب د‌یونیزه استریل و عاری از نوکلئاز برای فرآیند شست‌وشوی محصول

4.1. روش شستشو نمونه‌های محصولات تازه جهت تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

در ادامه روش استاندارد شست‌وشوی محصولات تازه جهت تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis توضیح داده شده است. این روش برای سبزیجات برگ‌دار و گیاهان معطر یا سبزیجات مقاوم مناسب است. لازم است تغییراتی که در پروتکل برای نمونه‌های حساس (مثل تمشک‌ها) ذکر شده رعایت شود. زیرا در صورت عدم دقت، این نوع میوه‌ها مقدار زیادی ذرات زائد یا پکتین آزاد می‌کنند.

نکته: سانتریفیوژ کردن محلول شست‌وشو در تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس طبق دستور زیر و با استفاده از روتورهای زاویه متغیر یا سویینگ (swinging-bucket rotor) انجام می‌شود. سرعت ترمز دستگاه باید روی عدد ۶ (از مقیاس ۰ تا ۹) تنظیم شود.

1.4.1. طرز تهیه محلول شستشوی میوه و سبزیجات Alconox®

۱. آماده‌سازی محلول ذخیره ۱٪ Alconox : میران 10 گرم Alconox را در ۱ لیتر آب مقطر حل کنید.

۲. آماده‌سازی محلول شستشو ۰.۱٪ Alconox : مقدار 200 میلی‌لیتر از محلول ذخیره ۱٪ را با ۱۸۰۰ میلی‌لیتر آب مقطر مخلوط کنید.

2.4.1. وزن کردن نمونه مورد بررسی

مقدار محصولی که باید جهت تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس، آنالیز شود را داخل کیسه فیلتردار BagPage®+ وزن کنید (۲۵ گرم محصول تازه یا ۵۰ گرم توت تازه).

3.4.1. افزودن محلول شست‌وشو و آماده‌سازی کیسه

به نمونه محصول درون کیسه فیلتردار، ۱۰۰ میلی‌لیتر محلول ۰.۱٪ Alconoxاضافه کنید. بخش پایینی کیسه را صاف روی میز قرار دهید و لبه‌ی باز کیسه را به سمت یک تکیه‌گاه عمودی تا کنید (تصویر 2).

روش شست و شوی نمونه های سیکلوسپورا کایتاننسیس — تصویر 2

کیسه‌هایی که حاوی سبزیجات برگ‌دار یا سبزیجات مقاوم هستند (بجز نمونه‌های حساس مثل توت‌ها) باید چند بار به آرامی با نوک انگشت‌ها ماساژ داده شوند تا بیشتر هوای داخل آن خارج شود.
کیسه‌های حاوی توت بدون ماساژ و بدون خارج کردن هوا بسته شوند. در نهایت، درب کیسه‌ها با گیره بسته شود.

4.4.1. شست‌وشوی کیسه‌ها

کیسه‌های بسته‌شده حاوی سبزیجات برگ‌دار جهت تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس ، را به صورت تخت داخل یک سینی روی راکر شیکر (Rocking platform) قرار دهید. لبه‌های بسته‌شده آن‌ها را به دیواره‌های سینی تکیه دهید تا از نشت احتمالی جلوگیری شود (تصویر 3) .کیسه‌ها روی هم چیده می‌شوند تا همگی جا شوند. سپس در دمای اتاق به مدت ۳۰ دقیقه با سرعت ۸۵ دور در دقیقه (معادل تنظیم دستگاه Stovall Belly Dancer روی ۷.۰ با حداکثر شیب) تکان داده شوند. پس از ۱۵ دقیقه، کیسه‌ها برگردانده شوند.

کیسه‌های حاوی توت باید به صورت ایستاده در سینی قرار داده شوند تا تماس بهتر بین محلول شست‌وشو و بافت میوه ایجاد شود (تصویر 4). سپس به مدت ۳۰ دقیقه با سرعت کم به آرامی تکان داده شوند. (مثلاً ۱۲ حرکت در دقیقه با Hoefer Red Rocker روی ۵.۰)

روش شت‌و‌شوی نمونه‌های Cyclospor cayetanensis — تصویر 4

5.4.1. جمع‌آوری سوپرناتانت

کیسه‌ها را باز کرده و مایع رویی سوپرناتانت (Supernatant) را از سمت فیلتر کیسه‌های BagPage®+به دو لوله سانتریفیوژ مخروطی ۵۰ میلی‌لیتری برچسب‌گذاری‌شده منتقل کنید. برای انتقال از پیپت سرولوژیک استفاده کنید.

6.4.1. سانتریفیوژ کردن محلول شست‌وشو

ذرات حاوی اووسیت‌ها را با استفاده از سانتریفیوژ روتورهای زاویه متغیر یا سویینگ، به مدت ۲۰ دقیقه در سرعت ۲,۰۰۰ g × جداسازی کنید و از تنظیم ترمز روی 6 (در مقیاس 0 تا 9) برای کاهش سرعت استفاده شود.

7.4.1. شست‌وشوی دوباره کیسه‌ها

حین سانتریفیوژ، به هر کیسه فیلتردار حاوی محصول، ۱۰۰ میلی‌لیتر محلول ۰.۱٪ Alconox®اضافه کنید. سپس کیسه را سه تا چهار بار به آرامی به طرفین خم کنید تا سطوح مواد غذایی و سطح داخلی کیسه شسته شود. کیسه‌ها را در همان حالت تکیه‌داده‌شده به سطح عمودی قرار دهید تا در مرحله 1-4-9 مورد استفاده قرار گیرند.

8.4.1. کاهش حجم سوپرناتانت

پس از سانتریفیوژ با استفاده از پیپت پاستور شیشه‌ای کوتاه که به شیلنگ و فلاسک فیلتردار متصل است و به خلأ آزمایشگاه وصل شده، سوپرناتانت هر لوله ۵۰ میلی‌لیتری را برداشت کنید. تقریباً ۴ میلی‌لیتر انتهایی سوپرناتانت را باقی بگذارید تا رسوب باقی‌مانده در ته لوله به هم نخورد. سوپرناتانت برداشت شده را به ظرف ضایعات منتقل کنید.

9.4.1. ترکیب شست‌وشو و شستشوی دوم

محلول شست‌وشوی دوم از هر کیسه را به دو لوله 50 میلی‌لیتری حاوی رسوب شست‌وشوی اول اضافه کنید. سپس به مدت ۲۰ دقیقه با سرعت ۲,۰۰۰ g × سانتریفیوژ کنید تا ذرات شسته‌شده‌ی ترکیب شده ته‌نشین شوند. پس از سانتریفیوژ، همانند قبل، تمام سوپرناتانت هر لوله را به جز حدود ۴ میلی‌لیتر باقی‌مانده، بدون آسیب رساندن به رسوب‌ها، با پیپت پاستور تحت خلأ دور بریزید.

10.4.1. ترکیب و انتقال رسوب‌ها به لوله 15 میلی‌لیتری

هر جفت رسوب حاصل از شست‌وشو را با پیپت سرولوژیک ۵ میلی‌لیتری در مایع باقی‌مانده شست‌وشو دوباره به حالت معلق درآورید و به یک لوله سانتریفیوژ مخروطی ۱۵ میلی‌لیتری منتقل کنید.

سپس هر یک از دو لوله ۵۰ میلی‌لیتری خالی را با ۲ میلی‌لیتر آب دیونیزه شست‌وشو دهید و مایع شست‌وشو را به محتویات لوله ۱۵ میلی‌لیتری اضافه کنید.

لوله ۱۵ میلی‌لیتری را به مدت ۲۰ دقیقه با سرعت ۲,۰۰۰ g × سانتریفیوژ کنید تا رسوب تشکیل شود. پس از سانتریفیوژ، تقریباً 1 میلی‌لیتر سوپرناتانت باقی گذاشته و رسوب را در آن حل کنید و به یک لوله 2 میلی‌لیتری FastPrep® خالی منتقل کنید. (بدونBeads)

رسوب باقی‌مانده را در همان مقدار اندک سوپرناتانت داخل لوله ۱۵ میلی‌لیتری معلق کرده و به یک لوله FastPrep ۲ میلی‌لیتری خالی (بدون دانه‌های شیشه‌ای) منتقل کنید. سپس لوله ۱۵ میلی‌لیتری خالی را با ۰.۴ میلی‌لیتر آب دیونیزه شست‌وشو داده و این مایع را به لوله ۲ میلی‌لیتری اضافه کنید.

اگر حجم کل رسوب معلق و مایع شست‌وشوی لوله بیش از ظرفیت لوله ۲ میلی‌لیتری بود، بخشی از نمونه را در همان لوله FastPrep با سرعت ۱۴,۰۰۰ g × به مدت ۴ دقیقه سانتریفیوژ کنید. سپس سوپرناتانت را به‌گونه‌ای خارج کنید که رسوب معلق در ته لوله به هم نخورد و مابقی رسوب و مایع شست‌وشو را دوباره به همان لوله اضافه کنید.

11.4.1. سانتریفیوژ نهایی لوله 2 میلی‌لیتری

لوله‌های ۲ میلی‌لیتری FastPrep که حاوی بقایای شست‌وشو از مرحله 10-4-1 هستند را با سرعت ۱۴,۰۰۰ g × به مدت ۴ دقیقه سانتریفیوژ کنید. سپس تقریباً 100–200 µL سوپرناتانت را دور بریزید بدون اینکه رسوب جابجا شود.

نکته: اگر حجم نمونه رسوب معلق‌شده بیش از حدود ۸۵۰ میکرولیتر باشد، باید نمونه به دو لوله ۲ میلی‌لیتری FastPrep تقسیم شود.

12.4.1. نگهداری یا ادامه استخراج DNA

نمونه‌ها را می‌توان یک شب در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری کرد یا بلافاصله طبق توضیحات بخش بعدی جهت جداسازی DNA در تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis مورد استفاده قرار داد.

2. جداسازی DNA از رسوب ذرات باقی مانده بعد از شست‌وشوی محصولات تازه با استفاده از کیت FastDNA® SPIN مخصوص خاک

استخراج DNA از محلول‌های شست‌وشوی محصول زیر هود آزمایشگاهی انجام می‌شود . این کار با استفاده از کیت FastDNA SPIN مخصوص خاک در تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس انجام خواهد شد. عملیات فوق طبق دستورالعمل اصلاح‌شده صورت می‌گیرد.

1.2. آماده‌سازی مواد قبل از شروع استخراج DNA

افزودن ۱۰۰ میلی‌لیتر اتانول ۱۰۰٪ به بطری SWES-M محلول شست‌وشو*
لوله‌های Lysing Matrix E حاوی دانه‌ها*
لوله‌های میکروسانتریفیوژ ۲ میلی‌لیتری
لوله‌های فالکون ۱۵ میلی‌لیتری حاوی ۱ میلی‌لیتر Binding Matrix معلق‌شده*
فیلترهای سانتریفیوژ (Spin Filters) درون لوله‌های جمع‌آوری (Catch tubes)*
یک سری دیگر از لوله‌های جمع‌آوری (Catch tubes)*

*این موارد در داخل کیت FastDNA® SPIN مخصوص خاک وجود دارند.

حال با در دست داشتن مواد مورد نیاز طبق پروتکل اصلاح ‌شده استخراج DNA با FastDNA SPIN در تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis که در زیر مرحله به مرحله توضیح داده شده است، پیش روید.

2.2. پروتکل اصلاح شده استخراج DNA با FastDNA SPIN

1.2.2. جمع‌آوری نمونه‌ها برای استخراج DNA

نمونه‌هایی که باید استخراج شوند را از مرحله 1-4-11 جمع‌آوری کنید و یک لوله خالی FastPrep را به‌عنوان کنترل استخراج DNA اضافه نمایید.

2-2-2 آماده‌سازی لوله‌ها با افزودن beads

به دقت beads موجود در هر لوله Lysing Matrix E، تأمین‌شده در کیت (FastDNA Spin) را به هر لوله آماده‌شده در مرحله 2-1 منتقل کنید.

3.2.2. افزودن بافر

مقدار 222 میکرولیتر بافر MT اضافه کنید.

4.2.2. تنظیم حجم نهایی با بافر سدیم فسفات و بستن لوله

مقدار ۹۷۸ میکرولیتر (یا کمتر) بافر سدیم فسفات اضافه کنید تا به حداکثر ارتفاع پر شدن لوله برسید؛ به‌طوری‌که حداقل ۱ سانتی‌متر فضای خالی از هوا در بالای لوله باقی بماند تا فرآیند ضربه‌زدن به دانه‌ها (bead-beating) به‌طور مؤثر انجام شود (تصویر 5). سپس درپوش لوله را محکم ببندید.

پروتکل اصلاح شده استخراج DNA در Cyclospora cayetanensis — تصویر 5

5.2.2. استخراج مکانیکی DNA با bead-beating

نمونه‌های تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس را به دستگاه FastPrep-24 منتقل کرده و با روش bead-beating، با تنظیم ۶.۵ متر بر ثانیه (حدود ۴۰۰۰ دور در دقیقه) به مدت ۶۰ ثانیه هموژنیزه کنید. بلافاصله پس از اتمام کار، نگهدارنده لوله‌ها را از دستگاه خارج کرده و به مدت ۳ دقیقه روی یخ قرار دهید. سپس نگهدارنده را دوباره به دستگاه بازگردانده و مراحل bead-beating و قرار دادن روی یخ را تکرار کنید .لوله‌ها را از نگهدارنده خارج کرده و به مدت ۱۵ دقیقه با سرعت ۱۴,۰۰۰ g × سانتریفیوژ کنید.

6.2.2. افزودن PPS

سوپرناتانت را به یک لوله ۲ میلی‌لیتری تمیز منتقل کنید. سپس ۲۵۰ میکرولیتر ^[2] PPS (محلول رسوب دهنده پروتئین) اضافه کرده و با دست، لوله را ۱۰ بار وارونه کنید تا مخلوط شود .

7.2.2. سانتریفیوژ و جداسازی سوپرناتانت

به مدت ۵ دقیقه با سرعت ۱۴,۰۰۰ g × سانتریفیوژ کنید . سپس سوپرناتانت را به یک لوله فالکون ۱۵ میلی‌لیتری تمیز حاوی ۱ میلی‌لیتر Binding Matrix معلق منتقل کنید.

8.2.2. آمیختن سوسپانسیون و رسوب‌دادن ماتریس سیلیکا

لوله‌ها را روی دستگاه روتاتور قرار داده یا با دست به مدت ۲ دقیقه وارونه کنید، سپس اجازه دهید ماتریس سیلیکا به مدت ۳ دقیقه ته‌نشین شود . لوله‌های ۱۵ میلی‌لیتری را به طور کوتاه با سرعت ۱,۰۰۰ g × به مدت ۱ دقیقه در روتورهای زاویه متغیر یا سویینگ سانتریفیوژ کنید.

9.2.2. جداکردن مقداری از سوپرناتانت پس از رسوب

مجموعاً ۱.۴ میلی‌لیتر سوپرناتانت از هر لوله برداشته و دور بریزید (در دو بخش ۷۰۰ میکرولیتر).

10.2.2. سانتریفیوژ و عبور نمونه از SPIN Filter

ماتریس را در سوپرناتانت باقی‌مانده دوباره معلق کرده و حدود ۷۰۰ میکرولیتر از آن را به SPIN Filter در یک لوله جمع‌آوری (catch tube) منتقل کنید. به مدت ۱ دقیقه با سرعت ۱۴,۰۰۰ g × سانتریفیوژ کنید. لوله جمع‌آوری را خالی کرده و هر مخلوط باقی‌مانده را دوباره به SPIN Filter اضافه کنید. سپس همانند قبل سانتریفیوژ کرده و دوباره لوله جمع‌آوری را خالی کنید.

11.2.2. افزودن بافر شستشو و مخلوط کردن

به هر فیلتر، ۵۰۰ میکرولیتر SWES-M آماده اضافه کنید. با دقت، با پیپت به آرامی مخلوط را معلق کنید .

12.2.2. سانتریفیوژ و تعویض لوله جمع‌آوری

به مدت ۱ دقیقه با سرعت ۱۴,۰۰۰ g × سانتریفیوژ کنید، لوله جمع‌آوری را خالی کرده و جایگزین کنید.

13.2.2. سانتریفیوژ نهایی

به مدت ۲ دقیقه با سرعت ۱۴,۰۰۰ g × سانتریفیوژ کنید تا ماتریس خشک شود. لوله جمع‌آوری را دور انداخته و با لوله جمع‌آوری جدید جایگزین کنید .

14.2.2. خشک کردن فیلتر در دمای اتاق

فیلتر را به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق و فضای باز خشک کنید.

15.2.2. شستشوی DNA با محلول DES و حرارت‌دهی

751 میکرولیتر ^[3] DES (محلول شست و شو DNA) به ماتریس داخل SPIN Filter اضافه کنید. ماتریس Binding را با نوک پیپت به آرامی هم بزنید تا دوباره معلق شود. سپس به مدت ۵ دقیقه در بلوک حرارتی با دمای ۵۵ درجه سانتی‌گراد قرار دهید.

16.2.2. استخراج DNA و خارج کردن فیلتر

با سرعت ۱۴,۰۰۰ g × به مدت ۱ دقیقه سانتریفیوژ کنید تا DNA استخراج‌شده جمع‌آوری شود، سپس SPIN Filter را دور بیندازید.

17.2.2. نگهداری نمونه‌های DNA

نمونه‌های DNA در تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس را می‌توان در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد تا ۲ روز نگهداری کرد یا برای نگهداری طولانی‌تر در دمای ۲۰ -یا ۸۰- درجه سانتی‌گراد قبل از انجام مرحله تشخیص Real Time PCR ذخیره کرد.

3. روش تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis به کمک Real Time PCR

این روش تحلیلی، یک روش Real Time PCR برای تشخیص مولکولی C. cayetanensis ارائه می‌دهد. این روش جایگزین روش‌های Real Time PCR موجود در فصل‌های A19 و B19 کتاب FDA BAM می‌شود. پروتکل Real Time PCR که در ادامه توضیح داده شده، مزایای متعددی دارد، از جمله افزایش ویژگی اختصاصی عمل کردن . (specificity) به عنوان مثال این روش موجب کاهش احتمال آلودگی محیط آزمایشگاه توسط آمپلیکون‌ها، که معمولاً با PCR تو در تو (nested PCR) ایجاد می‌شوند، خواهد شد.

این روش تحلیلی، یک روش Real Time PCR برای تشخیص مولکولی C. cayetanensis ارائه می‌دهد. این روش جایگزین روش‌های Real Time PCR موجود در فصل‌های A19 و B19 کتاب FDA BAM می‌شود. پروتکل Real Time PCR که در ادامه توضیح داده شده، مزایای متعددی دارد، از جمله افزایش ویژگی اختصاصی عمل کردن. (specificity) به عنوان مثال این روش موجب کاهش احتمال آلودگی محیط آزمایشگاه توسط آمپلیکون‌ها، که معمولاً با PCR تو در تو (nested PCR) ایجاد می‌شوند، خواهد شد.

آزمایش Real-Time PCR یک واکنش دوگانه (Duplex) است که در آن ژن میتوکندری چندنسخه‌ای Cyclospora cayetanensis برای تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس هدف قرار می‌گیرد. همچنین یک کنترل داخلی تقویت (^[4]IAC) هم به واکنش اضافه می‌شود تا اگر ترکیبات موجود در نمونه غذایی باعث مهار واکنش شدند، قابل شناسایی باشد.

کنترل داخلی تقویت

بیشتر بدانید

کنترل داخلی تقویت (Internal Amplification Control – IAC)

این کنترل یک قطعه DNA یا RNA مصنوعی یا طبیعی است که همراه نمونه اصلی در واکنش PCR اضافه می‌شود تا اطمینان حاصل شود که فرآیند تکثیر (Amplification) به درستی انجام شده است.

ویژگی‌ها و کاربردها:

تشخیص اختلالات واکنش: اگر PCR به هر دلیلی (مثلاً وجود مهارکننده‌ها در نمونه) متوقف شود یا ناکارآمد باشد، کنترل داخلی نشان می‌دهد که نتیجه منفی واقعی است یا به دلیل مشکل تکنیکی منفی شده است.
افزایش اطمینان: وجود IAC باعث می‌شود که نتایج آزمایش قابل اعتمادتر باشند.
معمولاً در واکنش‌های تشخیصی مولکولی مانند تشخیص ویروس‌ها، باکتری‌ها یا انگل‌ها استفاده می‌شود.

1.3. تجهیزات و مواد مصرفی تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس

سیستم Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR با نسخه‌های نرم‌افزاری ۱.۴، ۲.۰ یا ۲.۳ و نسخه‌های جدیدتر
لوله‌ها و پلیت واکنش قابل استفاده:

لوله استریپ با حجم ۰.۱ میلی‌لیتر و .MicroAmp® Optical 8-Cap Strips شماره‌های کاتالوگ: 4358293 و 4323032 (ThermoFisher Scientific) یا معادل آن.
پلیت 96 خانه MicroAmp® Fast Optical، حجم ۰.۱ میلی‌لیتر و فیلم چسبنده Optical .MicroAmp® شماره‌های کاتالوگ 4346907: و 4311971 (ThermoFisher Scientific) یا معادل آن.

سانتریفیوژ رومیزی که قادر به چرخش پلیت 96 خانه باشد یا سانتریفیوژ مناسب برای لوله های استریپ
سانتریفیوژ رومیزی که مناسب لوله‌های میکروتیوب ۱.۵ تا ۲.۰ میلی‌لیتری باشد.
میکروپیپت‌ها.
سرپیپت‌های مقاوم در برابر آئروسل.
دستکش لاتکس یا نیتریل.
ورتکس میکسر.
لوله‌های میکروسانتریفیوژ ۱.۵ میلی‌لیتری فاقد DNase و با ویژگی چسبندگی کم. (low retention)

2.3. واکنش‌گرها (Reagents) در تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

PrimeTime™ Gene Expression (IDT) مستر میکس شماره کاتالوگ 1055770 (۱ × ۱ میلی‌لیتر) یا 1055772 (۱ × ۵ میلی‌لیتر).
واکنشگر شامل یک لوله جداگانه حاوی رنگ مرجع (reference dye – ROX) است که قبل از استفاده باید طبق دستورالعمل سازنده به Master Mix اضافه شود. این کار برای تنظیم سطح low reference dye در دستگاه Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR لازم است.
بافر TE استریل و فاقد DNase با ۷.۵ pH ( ۱۰ میلی‌مولار Tris، ۰.۱ میلی‌مولار EDTA، 8 pH)

جدول 1. ترکیبات Tris-EDTA

حجم	محلول مصرفی
100µL	تریس ۱ مولار با pH 7.5
20µL	EDTA با غلظت ۰.۰۵ مولار
9.88mL	آب مخصوص PCR (عاری از RNAs/DANs)

پرایمرها، محلول استوک ۵۰۰ میکرومولار (جدول 2 و جدول 3).
پروب‌ها، محلول استوک ۱۰۰ میکرومولار (جدول 4).
هدف کنترل داخلی تقویت (IAC Target: HMultra130-synIAC) ، با غلظت کاری 1E7 نسخه در هر .µL (دستورالعمل سفارش و آماده‌سازی را در بخش 3-6 مشاهده کنید.)
کنترل مثبت (Mit1AA gblock)، با غلظت 5E2 نسخه در هر . µL دستورالعمل سفارش و آماده‌سازی در بخش 3-6 موجود است.

توجه: در این مقاله هر جا عباراتی مانند 5E2 دیدید، E به معنای “ضرب در 10 به توان …” است. مثلا 5E2 به معنای 5 ضرب در ده به توان 2 که معادل 500 است، می‌باشد.

کنترل منفی (آب فاقدDNase).

پروب، کنترل مثبت و کنترل منفی

بیشتر بدانید

پروب (Probe)

در آزمایش‌های مولکولی و PCR واقعی (Real-Time PCR)، پروب یک قطعه کوتاه DNA یا RNA با برچسب فلورسانس است که برای تشخیص توالی خاص هدف طراحی می‌شود.

ویژگی‌ها و کاربردها:

معمولاً در وسط توالی هدف قرار می‌گیرد و فلوروفور (رنگ فلورسانس) و کوئنچر (Quencher) دارد.
زمانی که پلیمراز پروب را می‌شکند یا به آن متصل می‌شود، سیگنال فلورسانس آزاد می‌شود و مقدار آن با تعداد نسخه‌های هدف متناسب است.
باعث می‌شود تشخیص توالی خاص دقیق‌تر و حساس‌تر از روش‌های معمولی PCR باشد.

کنترل مثبت (Positive Control):

شامل نمونه‌ای است که حتماً توالی هدف در آن وجود دارد.
هدف: تأیید اینکه واکنش PCR یا هر آزمایش دیگری به درستی کار می‌کند.
اگر کنترل مثبت نتیجه منفی بدهد، یعنی مشکلی در واکنش وجود دارد.

کنترل منفی (Negative Control):

شامل نمونه‌ای بدون توالی هدف است (مثلاً آب مقطر یا لوله خالی).
هدف: بررسی آلودگی یا خطای واکنش.
اگر کنترل منفی مثبت شود، یعنی نمونه یا محیط آزمایش به توالی هدف آلوده شده است.

3.3. دستورالعمل‌های سفارش و آماده‌سازی واکنش‌گرها در تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

تمام پرایمرها، پروب‌ها و DNA کنترل هدف (Target control DNAs) در تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis به صورت تجاری توسط Integrated DNA Technologies (IDT) در Coralville، ایالت آیووا، سنتز می‌شوند.

1.3.3. پرایمرهای تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

تمام پرایمرهای تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis از IDT سفارش داده می‌شوند و در غلظت کاری ۵۰۰ میکرومولار نرمالیزه شده و در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌شوند.

دستورالعمل سفارش پرایمرهای تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس :

در صفحه آنلاین سفارش IDT، گزینه “Custom DNA Oligos” را انتخاب کنید.
از منوی کشویی “Normalization”، گزینه “Create a custom formulation” را انتخاب کنید.
گزینه “Full product yield, to a specified µMolar concentration” را انتخاب کرده و مقدار ۵۰۰ را وارد کنید و IDTE 8.0 pH را انتخاب نمایید.
نام نرمال‌سازی را “500 µM” گذاشته و ذخیره کنید.
سپس در صفحه Oligo Entry، گزینه‌های مربوط به هر پرایمر را مطابق مشخصات هر پرایمر وارد کنید.

جدول 2. دستورالعمل سفارش پرایمرها

حجم	یک مقیاس بین ۲۵ نانومول و ۱ میکرومول انتخاب کنید.
نرمال‌سازی	۵۰۰ میکرومولار (µM)
خالص‌سازی	جداسازی نمک به روش استاندارد

جدول 3. نام و توالی پرایمر‌ها

	نام آیتم	توالی
پرایمرهای forward برای تقویت هدف میتوکندریایی C. cayetanensis	Mit1C-f	5′-TCTATTTTCACCATTCTTGCTCAC-3′
پرایمرهای reverse برای تقویت هدف میتوکندریایی C. cayetanensis	Mit1C-r	5′-TGGACTTACTAGGGTGGAGTCT-3′
پرایمرهای forward برای تقویت هدف IAC	dd-IAC-f	5′-CTAACCTTCGTGATGAGCAATCG-3′
پرایمرهای reverse برای تقویت هدف IAC	dd-IAC-r	5′-GATCAGCTACGTGAGGTCCTAC-3’

4.3. پروب‌های تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

برای تشخیص اهداف C. cayetanensis و IAC از پروب‌های هیدرولیز سبک Taqman استفاده می‌شود.

پروب cayetanensis با رنگ گزارشگر’۵ FAM نشانه‌گذاری شده و به صورت دوگانه خاموش (quenched) است: یک ZEN داخلی و یک Iowa Black® FQ (IABkFQ) در انتهای’۳ آن قرار دارد.

به زبان ساده:

FAM: سیگنال فلورسانس هنگام اتصال یا شکست پروب ایجاد می‌شود.
ZEN داخلی و IABkFQ: باعث خاموش شدن سیگنال می‌شوند تا فقط هنگام تشخیص توالی هدف، فلورسانس آزاد شود و سیگنال دقیق باشد.
پروب IAC با رنگ گزارشگر’ ۵ Cy5 نشانه‌گذاری شده و به صورت دوگانه خاموش (quenched) است: یک TAO داخلی و یک Iowa Black® RQ-Sp (IAbRQSp) در انتهای’۳ آن قرار دارد.
تمام پروب‌های تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس از IDT سفارش داده شده‌اند و طبق دستورالعمل، برای رسیدن به غلظت کاری هیدراته شده و در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌شوند.

1.4.3. دستورالعمل سفارش پروب‌های تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

در صفحه آنلاین سفارش IDT، گزینه “Custom qPCR Probes” را انتخاب کنید.
سپس PrimeTime qPCR Probes را انتخاب کنید.
مقیاس ۲۵۰ نانومول یا ۱ میکرومول را انتخاب کنید.
توالی نوکلئوتیدی پروب را وارد کرده و گزینه‌های ” ’۵ Dye / ۳’ Quencher” را مطابق جدول 4 برای هر پروب انتخاب کنید.
هیچ گزینه‌ای تحت بخش “Services” لازم نیست انتخاب شود.

جدول 4: اطلاعات سفارش پروب

	پروب برای شناسایی هدف IAC	پروب برای شناسایی هدف C. cayetanensis
نام آیتم	dd-IAC-Cy5	Mit1P-FAM
توالی	5’AGCTAGTCGATGCACTCCAGTCCTCCT-3′	5′-AGGAGATAGAATGCTGGTGTATGCACC -3′
کُدِ ناحیه 5 پرایم	/Cy5/	/56-FAM/
خاموش‌کننده در انتهای 3 پرایم	TAO-3’ Iowa Black® RQ-Sp	ZEN-3’ Iowa Black® FQ
کُدِ انتهای 3 پرایم	/3IAbRQSp/	/3IABkFQ/

5.3. آماده‌سازی محلول‌های کاری پروب‌های تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

100µM Mit1P-FAM: پروب خشک (lyophilized) را در TE buffer استریل و فاقد DNase هیدراته کنید و حجم مورد نیاز برای رسیدن به غلظت نهایی ۱۰۰ میکرومولار را طبق برگه مشخصات پروب IDT اضافه کنید. سپس محلول را ورتکس کرده و به‌طور کوتاه سانتریفیوژ کنید.

100µM dd-IAC-Cy5: پروب خشک را در TE buffer استریل و فاقد DNase هیدراته کنید و حجم مورد نیاز برای رسیدن به غلظت نهایی ۱۰۰ میکرومولار را طبق برگه مشخصات پروب IDT اضافه کنید. سپس محلول را ورتکس کرده و به مدت کوتاه سانتریفیوژ کنید.

6.3. هدف کنترل داخلی تقویت (IAC Target) در تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس

هدف واکنش IAC (HMultra130-synIAC) یک توالی DNA مصنوعی ۲۰۰ جفت باز (bp) است که بر اساس کنترل داخلی تقویت توسعه‌یافته توسط Deer و همکاران، در سال ۲۰۱۰ ساخته شده است.

1.6.3. دستورالعمل سفارش:

در صفحه سفارش آنلاین IDT، گزینه “Ultramer Oligos (up to 200 bases)” را انتخاب کنید.
در صفحه Oligo Entry، گزینه‌های مربوطه را وارد یا انتخاب کنید (جزئیات دقیق توالی و مشخصات هر IAC در ادامه جدول یا متن دستورالعمل ارائه شده است).

جدول 5. توضیحات الیگونوکلئوتیدهای Ultramer

نام آیتم	HMultra130-synIAC
حجم	الیگونوکلئوتید DNA Ultramer™ با مقدار ۴ نانومول (4 nmole)
نرمال‌سازی	ندارد
خالص‌سازی	تصفیه استاندارد (Standard Desalting)

TACAGCACCCTAGCTTGGTAGAATCGATCAGCTACGTGAGGTCCTACGACGATCGCCAAGCATGCCCTAGCTAAGATGCATCGATTGCTCATCACGTACGTTAGGTCGACTAGGAGGACTGGAGTGCATCGACTAGCTAAGATGGTTCGATTGCTCATCACGAAGGTTAGGTCGACTACGAACGAGTCGTATTGCAGGTT

7.3. آماده‌سازی محلول کاری هدف IAC

آلترامر هدف IAC (HMultra130-synIAC) را مطابق دستورالعمل‌های زیر در بافر رقیق‌سازی TE با pH 7.5 هیدراته کنید تا به غلظت کاری ۱۰⁷× 1 µL/نسخه برسید. محلول‌های رقیق‌شده و محلول کاری را در دمای ۲۰ -درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید.

جدول 6. محلول کاری هدف کنترل داخلی تقویت(IAC)

(نسخه‌ها/µL) غلظت	HMultra130-synIAC هدف IAC: دستورالعمل هیدراتاسیون و رقیق‌سازی
5E12	قبل از باز کردن، آلترامر خشک‌شده (۴ نانومول) را سانتریفیوژ کنید تا محتویات در ته لوله جمع شوند. آن را در لوله اصلی با ۱۰۰۰ µL بافر رقیق‌سازی TE هیدراته کرده و برای مدت کوتاهی ورتکس کنید. سپس دوباره سانتریفیوژ کنید تا مایع در ته لوله جمع شود.
5E10	۱۰ µL از محلول ذخیره 5E12 را با ۹۹۰ µL TE در یک لوله جدید مخلوط کنید. سپس سانتریفیوژ کنید تا مایع در ته لوله جمع شود.
5E8	۱۰ µL از محلول ذخیره 5E10 را با ۹۹۰ µL TE در یک لوله جدید مخلوط کنید. سپس سانتریفیوژ کنید تا مایع در ته لوله جمع شود.
1E7	۱۰ µL از محلول ذخیره 5E8 را با ۴۹۰ µL TE در یک لوله جدید مخلوط کنید. سپس سانتریفیوژ کنید تا مایع در ته لوله جمع شود.

توجه: این مقدار به‌صورت تئوری محاسبه شده و تابعی از غلظت DNA، عدد آووگادرو، طول قالب و وزن متوسط یک جفت باز است. ابزارهای آنلاین رایگانی برای محاسبه این مقدار در دسترس هستند.

محاسبه تعداد نسخه‌های DNA هدف

مرحله ۱: چهار نانومول را با استفاده از ماشین‌حساب تبدیل مقدار مولی به وزن، برای اسیدهای نوکلئیک به میکروگرم DNA تبدیل کنید. وزن محاسبه‌شده برابر با ۵۱۹.۲ میکروگرم است.

مرحله ۲: از وزن محاسبه‌شده DNA (۵۱۹.۲ میکروگرم) و وزن مولکولی توالی (۶۱۸۸۲) برای محاسبه تعداد نسخه‌ها استفاده کنید. (این مقدار تقریباً 10¹⁵× ۵.۱۳۸ نسخه خواهد بود ) ( با فرض جرم هر جفت باز DNA برابر ۶۵۰ دالتون). از آنجا که هدف خشک‌شده در TE با غلظت µL ۱۰۰۰ حل شده است، تعداد تقریبی نسخه‌ها برابر ۱۰¹²×۵ µL /نسخه خواهد بود.)

توجه: یک روش اختیاری برای اندازه‌گیری دقیق DNA هدف این است که DNA خشک‌شده را در ۱۰۰۰ µL محلول TE حل کنیم.

سپس غلظت DNA را با کیت Qubit حساسیت بالا یا دستگاه Nanodrop اندازه‌گیری می‌کنیم (واحد: ng/µL). غلظت به دست آمده را در ماشین‌حساب تعداد نسخه‌ها وارد می‌کنیم تا تعداد دقیق نسخه‌ها در هر میکرولیتر مشخص شود. در نهایت، نمونه را رقیق می‌کنیم تا به ۱۰⁷× ۱ µL/نسخه برسد. رقت‌ها را در دمای ۲۰ –درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید.

8.3. کنترل مثبت در تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

DNA کنترل مثبت (Mit1AA gblock) یک قطعه ژنی مصنوعی bp ۲۴۵ دو رشته‌ای است که توسط IDT سنتز شده است. این توالی مربوط به منطقه ۴۳۲۵ تا ۴۵۶۹ bp ، در ژن میتوکندری C. cayetanensis است (Genbank: KP231180,1). علاوه بر این، این توالی شامل جهش‌های قابل ردیابی (T4385A و T4386A) در آمپلیکونی است که توسط پرایمرهای PCR در زمان واقعی استفاده می‌شود.

1.8.3. دستورالعمل سفارش:

در صفحه سفارش آنلاین IDT، گزینه “gBlocks Gene Fragments” را انتخاب کنید.
نام مورد و توالی را در صفحه gBlocks® Gene Fragments Entry وارد کنید:

Mit1AA gblock :نام آیتم

توالی (Sequence):

ACAGTTGGTTTTCTATTTTCACCATTCTTGCTCACTGTATTAGTATTATTTAATTTTACTAATAGAGAAGTTGGTACTACATCAGCTTCTCTGGTTTCATCAATTTGTTTAGGTGTTATTAGTACTGAGTTACTACTATTTGTTAGCTTCTTCTGGGGTGCATACACCAGCATTCTATCTCCTAGTTATGTAACAGACTCCACCCTAGTAAGTCCAACTGAGGGTCTTGTAAGTATCTCTAGTAG

روی Add to Order کلیک کنید و سپس در پنجره بازشده Terms and Disclosure، به همه پرسش‌ها پاسخ “No” بدهید. نام خود را در کادر Signature وارد کرده و شرایط و ضوابط (terms and conditions) را بپذیرید . سپس روی “Add to Cart” کلیک کنید. مقدار تحویلی از gBlock برابر با ۲۵۰ نانوگرم خواهد بود.

9.3. آماده‌سازی محلول کاری کنترل مثبت

کنترل مثبت gBlock (Mit1AA) را در بافر رقیق‌کننده TE با pH برابر 7.5، طبق دستورالعمل زیر هیدراته و رقیق کنید تا غلظت کاری برابر با ‎5E2‎ نسخه در هر میکرولیتر به دست آید. رقیق‌سازی‌ها را در دمای ‎20 -درجه سلسیوس ذخیره کنید. محلول کاری را می‌توان در دمای20 -یا 4 درجه سلسیوس نگهداری کرد. هر ۹۰ روز یک بار باید محلول کاری تازه از رقت ‎5E3‎ یخ‌زده تهیه شود.

جدول 7.محلول کاری کنترل مثبت (در تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس)

غلظت (نسخه در هر میکرولیتر)	کنترل مثبت Mit1AA: روش هیدراته‌سازی و رقیق‌سازی
2E9	قبل از باز کردن، gBlock لیوفیلیزه شده (۲۵۰ نانوگرم) را سانتریفیوژ کنید. سپس آن را در همان لوله اصلی با ‎500 µL‎ بافر رقیق‌کننده TE هیدراته کنید. کمی با ورتکس مخلوط کرده و به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ‎50‎ درجه سلسیوس قرار دهید. سپس دوباره کمی ورتکس کرده و یک بار دیگر سانتریفیوژ کنید تا تمام مایع به انتهای لوله جمع شود.
2E7	۱۰ میکرولیتر از محلول ذخیره 2E9 را با ۹۹۰ میکرولیتر بافر TE در یک لوله جدید مخلوط کنید. سپس لوله را سانتریفیوژ کنید تا تمام مایع به انتهای لوله جمع شود.
2E5	۱۰ میکرولیتر از رقت 2E7 را با ۹۹۰ میکرولیتر بافر TE در یک لوله جدید مخلوط کنید. سپس لوله را سانتریفیوژ کنید تا تمام محلول به ته لوله جمع شود.
5E3	۱۰ میکرولیتر از رقت 2E5 را با ۳۹۰ میکرولیتر بافر TE در یک لوله جدید مخلوط کنید. سپس لوله را سانتریفیوژ کنید تا تمام محلول به ته لوله جمع شود.
5E2	۵۰ میکرولیتر از رقت 5E3 را با ۴۵۰ میکرولیتر بافر TE در یک لوله جدید مخلوط کنید. سپس لوله را سانتریفیوژ کنید تا تمام محلول به ته لوله جمع شود.

توجه: این مقدار به صورت نظری محاسبه شده و بستگی به غلظت DNA، عدد آووگادرو، طول قالب و وزن متوسط هر جفت باز دارد. برای به‌دست آوردن این مقدار، ماشین‌حساب‌های آنلاین رایگانی هم وجود دارد.

1.9.3. محاسبه تعداد تقریبی نسخه‌های DNA

از مقدار(250 نانوگرم) DNA و وزن مولکولی توالی(۱۵۱۲۲۷.۲) برای محاسبه تعداد نسخه‌ها استفاده کنید. این تعداد تقریبا برابر با E12 نسخه خواهد بود (با فرض اینکه هر جفت باز DNA وزنی برابر ۶۵۰ دالتون دارد). چون هدف لیوفیلیزه (پودر DNA) در ۵۰۰ میکرولیتر TE حل شده است، تعداد تقریبی نسخه‌ها برابر با 2E9 نسخه در هر میکرولیتر می‌باشد.

2.9.3. روش اختیاری برای اندازه‌گیری دقیق

در تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس می‌توانید غلظت DNA (ماده لیوفیلیزه شده حل شده در ۵۰۰ میکرولیتر TE ) را با استفاده از کیت Qubit با حساسیت بالا یا Nanodrop اندازه‌گیری کنید. سپس غلظت به دست آمده (ng/µL) را در یک ماشین‌حساب تعداد نسخه‌ها وارد کرده و تعداد دقیق نسخه‌ها در هر میکرولیتر (copies/µL) را محاسبه کنید.

با این مقدار می‌توان محلول را رقیق کرد تا به غلظت 5E2 copies/µL برسد.

10.3. آماده‌سازی و اجرای واکنش

برای واکنش هدف C. cayetanensis و همچنین هدف IAC، میکس پرایمر/پروب باید تهیه شود.
قبل از ترکیب مخلوط‌ها، همه واکنش‌گرها را به‌طور کوتاه مخلوط (vortex) کرده و سانتریفیوژ کنید تا محتویات دوباره معلق شده و ته‌نشین نشوند.

1.10.3. میکس‌های پرایمر/پروب در تشخیص مولکولی : Cyclospora cayetanensis

این میکس‌ها باید در دمای ۲۰– درجه سانتی‌گراد و دور از نور نگهداری شوند.

جدول 8. محلول Mit1C Pr/Pro20X شامل پرایمرها با غلظت هر کدام ۱۲µM و پروب با غلظت µM۶

حجم	غلظت نهایی
۱۲.۰ µL پرایمر Mit1C-f با غلظت ۵۰۰ µM	۰.۶ µM در واکنش نهایی (برای پرایمر‌ها)
۱۲.۰ µL پرایمر Mit1C-r با غلظت ۵۰۰ µM	۰.۶ µM در واکنش نهایی (برای پرایمر‌ها)
۳۰.۰ µL پروب Mit1P-FAM با غلظت ۱۰۰ µM	۰.۳ µM (برای پروب) در واکنش نهایی
۴۴۶ µL بافر TE
حجم نهایی ۵۰۰ µL

جدول 9. محلول X synIAC Pr/Pro 20شامل پرایمرها با غلظت هر کدام ۵µM، پروب با غلظت ۵ µM، حاوی 10⁵× ۲نسخه از هدف synIAC

حجم	غلظت نهایی	حجم محتوی غلظت نهایی واکنش
۵.۰ µL پرایمر dd-IAC-f با غلظت ۵۰۰ µM	غلظت نهایی در واکنش: ۰.۲۵ µM	۵۰۰ µL
۵.۰ µL پرایمر dd-IAC-r با غلظت ۵۰۰ µM	غلظت نهایی در واکنش: ۰.۲۵ µM
۲۵.۰ µL پروب dd-IAC-Cy5 با غلظت ۱۰۰ µM	غلظت نهایی در واکنش: ۰.۲۵ µM
۱۰ µL هدف synIAC HMultra130 با غلظت 1×10⁷ نسخهµL/	تعداد نسخه نهایی در واکنش: 1×10⁴ نسخه در هر میکرولیتر (1E4 copies/µL)
بافر TE 455 میکرولیتر

2.10.3. مخلوط واکنش Real Time PCR برای حجم ۲۰ میکرولیتر در تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

تمام نمونه‌ها و کنترل‌ها همیشه به صورت سه تایی (triplicate) اجرا می‌شوند.
قبل از آماده‌سازی مخلوط واکنش، همه واکنش‌گرها را به‌طور کوتاه مخلوط و سانتریفیوژ کنید تا محتویات دوباره معلق شوند و ته‌نشین نگردند.
فرمول مستر میکس زیر برای اجرای یک تکرار (replicate) از یک نمونه کافی است.
برای هر اجرای آزمایش qPCR، حجم کافی از مخلوط واکنش را آماده کنید تا کنترل بدون قالب (NTC)، کنترل مثبت و نمونه‌ها، همه به شکل سه تایی اجرا شوند.
تعداد کل تکرارها (N) را برای یک آزمایش محاسبه کنید و حجم مستر میکس را بین N+1 تا N+3 آماده کنید تا برای همه تکرارها حجم کافی وجود داشته باشد

جدول 10. مخلوط واکنش تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis برای حجم ۲۰ میکرولیتر

اجزای مخلوط اصلی (Master Mix Components)	حجم
µL از محلول X2 primetime Gene expression master mix با رنگ مرجع کم (شرکت IDT)	10.0
حجم µL از مخلوط X 20 پرایمر/پروب Mit1C	1.0
حجم µL از مخلوط X 20 پرایمر/پروب synIAC	1.0
حجم آب دیونیزه بدون DNase به میکرولیتر	6.0
حجم نمونه یا کنترل به میکرولیتر	2.0
حجم کلی به میکرولیتر	20.0

۱۸ میکرولیتر از مخلوط واکنش را به هر چاهک یا لوله واکنش منتقل کنید.
سپس ۲ میکرولیتر از نمونه یا کنترل مناسب را به هر چاهک یا لوله واکنش اضافه کنید (جزئیات در بخش 3-10-3 ارائه شده است).

3.10.3. نمونه‌ها و کنترل‌ها در تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس

جدول 11. حجم نمونه‌ها و کنترل‌ها

نمونه و کنترل ها	حجم
NTC	۲.۰ µL آب دیونیزه بدون DNase
کنترل استخراج DNA	2.0 µL
نمونه ها	2.0 µL ( با غلظت اصلی و رقت یک چهارم)
کنترل مثبت	۲ Mit1AA gBlock µL با غلظت ۵×۱۰² نسخه در میکرولیتر

4.10.3. آماده‌سازی نمونه‌ها و کنترل‌ها

قبل از اضافه کردن نمونه‌ها و کنترل‌ها به چاهک‌ها یا لوله‌های واکنش، همه آن‌ها را به‌طور مختصر ورتکس کرده و سپس سانتریفیوژ کوتاه انجام دهید.
تمام نمونه‌های ناشناخته باید در همان اجرای آزمایش اولیه، هم به‌صورت غلظت اصلی (1X) و هم به‌صورت رقیق‌شده ¼ آنالیز شوند.

توجه: کنترل‌ها در رقت ¼ تست نمی‌شوند.

5.10.3. پروتکل رقیق‌سازی ¼نمونه

مقدار 5µL از نمونه را به یک میکروتیوب تمیز منتقل کنید.
به آن 5µL بافر TE اضافه کنید.

به‌خوبی مخلوط کرده و به‌طور کوتاه سانتریفیوژ کنید.

6.10.3. آماده‌سازی پلیت یا لوله‌ها برای اجرا

پلیت یا نوار لوله‌ها را با استفاده از دستگاه Fast Real-Time PCR ABI 7500 طبق الگوی پروتکل از پیش تعیین‌شده و روش اجرای توضیح داده ‌شده در پیوست ، به جهت تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس راه‌اندازی و اجرا کنید.

خط Threshold

بیشتر بدانید

در آزمایش‌های مولکولی مثل Real-Time PCR، منظور از Threshold:

یک خط مبنا یا سطح مشخص از سیگنال فلورسانس است.
وقتی شدت فلورسانس نمونه از این سطح بالاتر می‌رود، یعنی واکنش PCR واقعاً شروع به تکثیر کرده و نتیجه مثبت محسوب می‌شود.
چرخه‌ای که در آن، سیگنال از آستانه عبور می‌کند را Ct (Cycle threshold) یا “چرخه آستانه” می‌گویند.

11.3. تفسیر نتایج تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

1.11.3. نمونه‌های مثبت

نمونه‌ها در تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس تنها زمانی برای وجود  C. cayetanensis  مثبت در نظر گرفته می‌شوند که:

در تست اولیه یا در تست تکراری، دست‌کم یک تکرار نمونه یک سیگنال تقویتی صاف و نمایی/سیگموئیدی تولید کند.
مقدار ct≤38 برای هدف میتوکندریایی C. cayetanensis (Mit1C) در تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس ثبت شود.
واکنش هدف IAC می‌تواند منفی یا مثبت باشد.

2.11.3. نمونه های نیازمند بررسی بیشتر در تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

نمونه‌هایی نیاز به بررسی بیشتر دارند که یک نمونه در یک یا چند تکرار، برای هدف C. cayetanensis Mit1C سیگنال تقویتی نمایی/سیگموئیدی تولید کند، اما مقدار Ct > 38.0 باشد و واکنش هدف IAC مثبت یا منفی شود. در این حالت:

در آزمایشگاه‌های رسمی نظارتی: باید با HFP SME مشورت شود. بسته به نظر SME، ممکن است لازم باشد نمونه یک‌بار دیگر در سه‌تکرار (triplicate) هم در غلظت 1X و هم در ¼ رقت مورد آزمایش قرار گیرد.

3.11.3. نمونه‌های منفی

نمونه‌هایی در تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس منفی در نظر گرفته می‌شوند که:

واکنش هدف Mit1C C. cayetanensis در همه تکرارها مقدار Ct مشخصی نداشته باشد.
هیچ تکراری Ct کمتر یا برابر 38 نداشته باشد.
واکنش هدف IAC نمونه، میانگین Ct‌ای تولید کند که بیش از ۳ چرخه بالاتر از NTC نباشد.
در این حالت در تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis، نمونه منفی است و نیازی به اقدام بیشتری نیست.

4.11.3. نتایج نامعتبر در تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

اگر یکی یا چند تکرار از نمونه NTC (کنترل منفی) یا نمونه کنترل استخراج DNA در واکنش‌های هدف Mit1C نتیجه مثبت نشان دهند و از آستانه عبور کنند، اجرای آزمایش تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس نامعتبر است و باید تکرار شود.

اگر پس از تکرار اجرای آزمایش نامعتبر تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس ، نمونه کنترل استخراج DNA دوباره نتیجه مثبت بدهد و نمونه NTC منفی باشد، احتمالاً فرآیند استخراج DNA آلوده شده است. در این صورت، فرآیند استخراج DNA باید برای کل مجموعه نمونه‌های تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis دوباره انجام شود. در صورت امکان از نمونه‌های غذایی شسته‌شده اضافی استفاده گردد.

اگر در تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس یکی یا چند تکرار از نمونه کنترل مثبت برای cayetanensis Mit1C مقدار Ct مشخصی نداشته باشد، اجرای آزمایش نامعتبر است و باید دوباره انجام شود.

5.11.3. نتایج نامشخص تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis

اگر در آزمایش اولیه (یا پس از تکرار در صورت نیاز):

نمونه هیچ تکراری از هدف میتوکندریایی Mit1C انگل Ct ≤ 38.0 تولید نکند و سیگنال IAC (کنترل داخلی) نمونه یا نامشخص باشد، یا میانگین Ct آن بیش از ۳ چرخه بالاتر از کنترل منفی (NTC) باشد، یعنی نتیجه نمونه قابل اعتماد نیست و احتمالاً مهار واکنش PCR یا مشکل در نمونه در تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس وجود دارد.

در این حالت در آزمایشگاه‌های رسمی نظارتی: باید با HFP SME مشورت شود. بسته به نظر SME، ممکن است لازم باشد نمونه یک‌بار دیگر در سه‌تکرار (triplicate) هم در غلظت 1X و هم در ¼ رقت مورد آزمایش قرار گیرد.

4. سخن پایانی

این روش عملیاتی استاندارد (SOP) ارائه شده برای تشخیص مولکولی Cyclospora cayetanensis در محصولات تازه با استفاده از PCR Real Time، یک راهکار دقیق، حساس و تکرارپذیر را برای شناسایی این انگل فراهم می‌آورد. رعایت دقیق مراحل نمونه‌گیری، استخراج DNA، آماده‌سازی واکنش‌ها و تنظیمات دستگاه، نه تنها دقت نتایج را تضمین می‌کند بلکه قابلیت مقایسه نتایج بین آزمایشگاه‌های مختلف را نیز افزایش می‌دهد. اجرای این SOP (روش عملیاتی تشخیص مولکولی سیکلوسپورا کایتاننسیس ) می‌تواند به کاهش خطرات بهداشتی ناشی از آلودگی محصولات تازه کمک کرده و به عنوان یک مرجع علمی و عملی برای آزمایشگاه‌های کنترل کیفیت، مراکز تحقیقاتی و برنامه‌های نظارتی در سطح ملی و بین‌المللی مورد استفاده قرار گیرد. علاوه بر این، این روش پایه‌ای محکم برای توسعه روش‌های مولکولی پیشرفته‌تر و مطالعات آینده در زمینه شناسایی و نظارت بر انگل‌ها در مواد غذایی فراهم می‌کند.