مبانی سانتریفوژ

یکی از راه‌های متداول جداسازی، سانتریفوژ کردن است. سانتریفوژ کردن روشی است که اجزای یک مخلوط یا ترکیب را با استفاده از نیروی گریز از مرکز از یکدیگر جدا می‌کند. دستگاه سانتریفوژ (Centrifuge) تجهیزی است که عموماً توسط یک موتور الکتریکی عمل می‌کند، که در آن روتور، حول محور ثابت می‌چرخد. سانتریفوژ با استفاده از تاثیر نیروی گریز از مرکز (g-force)، مواد را با توجه به چگالی‌هایشان جدا می‌کند. انواع مختلف روش‌های جداسازی شامل ایزوپیکنیک (isopycnic)، اولترافیلتراسیون (ultrafiltration)،گرادیان چگالی (شیب چگالی)، جداسازی فازی و تشکیل رسوب می‌شود.

تشکیل رسوب رایج‌ترین نوع فرآیند سانتریفوژ ها است. در این فرآیند، ذرات بصورت رسوب در انتهای لوله سانتریفیوژ جمع می‌شود. به محلول شناور رویی، سوپرناتانت (supernatant) و به قسمت انتهای لوله پلت (Pellet)، رسوب یا ته‌نشین‌شده گفته می‌شود.

جداسازی فازی روشی برای جدا نموندن فاز جامد از مایع یا فاز مایع از مایع و … می‌باشد.

 اولترافیلتراسیون (ultrafiltration)، فناوری جداسازی ذرات معلق از محلول توسط ممبران است که بر مبنای غشای نیمه تراوا عملیات جداسازی را تا کمتر از 0.1 میکرون انجام می‌دهد.

روش ایزوپیکنیک (Isopycnic)، روشی برای جداسازی اسید نوکلئیک‌ها مانند DNA و غیره است که با همگن‌سازی سلول‌های متلاشی شده، برای جداسازی سلول به سلول کاربرد دارد.

در روش گرادیان چگالی  اجزای سلولی بر اساس چگالی خاص خود از هم جدا می‌شوند. چگالی در بالای لوله کمتر و در پایین لوله بیشتر است. در حین عمل سانتریفوژ هر جزء از عصاره‌ی سلولی به مکانی مشخص در لوله که چگالی آن مساوی با چگالی آن قسمت باشد، منتقل می‌شود.

در پروتکل‌های سانتریفوژ معمولاً نیروی نسبی گریز از مرکز (RCF) بصورت مضربی از شتاب جاذبه (g) ارائه می‌شود. RPM یا همان سرعت چرخش (دور در دقیقه) از دقت لازم برخوردار نیست.

اصول مهم در سانتریفوژ

به طور کلی میزان شتاب و سرعت چرخش سانتریفوژ، بر مبنای هدف سانتریفوژ کردن تعیین و مشخص می‌شود. شتاب به طور معمول بصورت مضربی از شتاب جاذبه (g) بیان می‌شود. مقدار شتاب گرانش استاندارد در سطح زمین (9.81 متر بر مجذور ثانیه) است. درک تفاوت بین RPM و RCF بسیار مهم است، زیرا دو روتور با قطرهای مختلف که با سرعت چرخش (RPM) یکسان می‌چرخند، نیروی نسبی گریز از مرکز (RCF) متفاوتی خواهند داشت.

با توجه به اینکه روتور در مسیری دایره‌ای حول محور مرکزی می‌چرخد، نیروی شتاب (نیروی نسبی گریز از مرکز) به صورت حاصل ضرب شعاع در مجذور سرعت زاویه‌ای (سرعت چرخش) محاسبه می‌شود. آنچه از ابتدا بعنوان “نیروی نسبی گریز از مرکز” (RCF) شناخته شده، همان اندازه شتابی است که در حین حرکت چرخشی به نمونه اعمال شده و بصورت ضریبی از شتاب جاذبه (g) اندازه‌گیری می‌شود.

مثال:

نیروی نسبی گریز از مرکز (RCF)

“شتاب نسبی سانتریفوژ ” معادل عبارت “نیروی نسبی گریز از مرکز” (RCF) که آن هم معادل عبارت “قدرت سانتریفوژ نمودن” می‌باشد که هر سه عبارت در محاوره استفاده می‌شوند.

نیروی گریز از مرکز (RCF) که به صورت ضریبی از شتاب جاذبه (g) ارئه می‌شود، فاقد دیمانسیون بوده و به جهت مقایسه‌ی میزان جداسازی و رسوب‌گذاری به کار می‌رود. این کمیت با استفاده از فرمول‌های ذیل محاسبه می‌شود.

همانطور که ذکر شد، هنگام استفاده از روتورهایی با شعاع‌های متفاوت برای سانتریفوژ ، (RCF (g-force یکسان باید استفاده شود.

در این مثال هر دو روتور می‌توانند لوله‌های 1.5 و 2 میلی‌لیتر را با سرعت مشابه (1400 دور بر دقیقه) بچرخانند ولی شتاب اعمال شده به نمونه‌ مطابق محاسبات بالا به شرح مقابل است: 13100g در مقابل 20817g، که در نهایت منجر به نتیجه‌های متفاوت می‌شوند. برای تسهیل در دستیابی دقیق‌تر به داده‌های موردنیاز، بعضی سانتریفوژ ها مستقیماً بر روی پنل خود دکمه‌ی تبدیل RPM و RCF دارند. اگر سانتریفوژ شما دکمه‌ی تبدیل RPM-RCF را نداشته باشد، می‌توانید برای این تبدیل از فرمول و یا از نوموگرام استفاده کنید.

جهت تبدیل آنلاین rpm به rcf و یا بالعکس، کلیک کنید.

k-factor پارامتری برای فاصله‌ی مناسب رسوب‌گذاری در یک لوله آزمایش است که نام دیگر این فاکتور، clearing factor یا فاکتور پاکسازی می‌باشد.

 این فاکتور راندمان رسوب‌گذاری نسبی دستگاه سانتریفوژ را در حداکثر سرعت چرخش نشان می‌دهد. به طور کلی، مقدار k-factor برای تخمین زمان (t بر حسب ساعت) مورد نیاز برای رسوب‌گذاری یک نمونه با یک ضریب رسوب‌گذاری مشخص (s  بر حسب سودبرگ) می‌باشد.

میزان K-factor کمتر بیانگر سرعت بالاتر جداسازی می‌باشد. مقدار k-factor عمدتاً توسط قطر روتور تعیین می‌شود. در مقایسه با  RPM/RCF ، استفاده از k-factor برای فرآیندهای سانتریفوژ عمومی اهمیت کمتری دارد. اما برای فرآیند اولتراسانتریفوژ ، k-factor پارامتر مناسبی جهت استفاده می‌باشد.

نحوه‌ی انتخاب سانتریفوژ متناسب با نیاز و کاربری

هنگام پیروی از یک پروتکل خاص، باید از به کارگیری روتور مشخص شده در پروتکل و تنظیم نیروی گریز از مرکز (RCF یا g-force)، دما و زمان مطابق با همان پروتکل اطمینان حاصل کرد. به طور کلی، برای انجام یک سانتریفوژ موفق، پارامترهای زیر باید تعیین شوند:

الف : نوع نمونه

ب : نوع لوله / ظرف نمونه‌گیری (لوله، پلیت، لام و …)

ج : نوع سانتریفوژ

د : نوع روتور

ه : نیروی نسبی گریز از مرکز

و : دمای مناسب در حین سانتریفوژ نمودن

روتورهای زاویه ثابت یا زاویه متغیر

رایج‌ترین روتورها در آزمایشگاه‌هایی که عمل سانتریفوژ را انجام می‌‌دهند، روتورهای زاویه ثابت و زاویه متغیر هستند. فقط برای چند کاربرد به روتورهای خاص مانند روتورهای Continuous-flow، روتورهای Drum و غیره نیاز است.

روتورهای زاویه ثابت (Fixed Angle /Angel head)

روتورهای زاویه ثابت برخلاف روتورهای زاویه متغیر، دارای قطعات متحرک نیستند. در نتیجه این روتورها نسبت به روتورهای زاویه متغیر در معرض تنش بسیار کمتری قرار می‌گیرند. این امر ایجاد نیروهای نسبی گریز از مرکز بالاتر و در نتیجه، زمان کمتر سانتریفوژ را ممکن می‌سازد. اما تنوع لوله‌ها و ظروف نمونه در این مدل از روتورها محدود می‌باشد. لوله‌ی حاوی نمونه نسبت به محور دوران، یک زاویه ثابت دارد که موقعیت رسوب کاملاً به این زاویه بستگی دارد به این صورت که رسوب هنگام چرخش، از دیواره‌ی لوله تا انتهای آن قرار می‌گیرد. زاویه‌ی این نوع روتورها از 25 تا 45 درجه می‌تواند متغیر باشد ولی زاویه قرارگیری لوله‌ها در اکثر روتورهای زاویه ثابت 45 درجه می‌باشد. هرچه زاویه قرارگیری لوله‌ها درون روتور بزرگتر باشد، رسوبات متراکم‌تر خواهند بود. زوایای کوچکتر روتور باعث پراکندگی رسوبات می‌شوند.

روتورهای زاویه متغیر یا شناور (Swing-bucket rotor or Swing-out head)

روتورهای زاویه متغییر امکان استفاده از لوله‌ها و ظروف نمونه‌برداری با حجم‌های مختلف شامل پلیت‌های SBS را به دلیل وجود آداپتورهای متنوع‌تر فراهم می‌کنند. قطعات متحرک روتورهای Continuous-flow زاویه متغیر، باعث افزایش تنش روتور و باگت‌ها می‌شوند و وزن باگت هم بر روی میله‌ها هم بر روی شیارها فشار وارد می‌کند. پس در مقایسه با روتورهای زاویه ثابت، نیروی نسبی گریز از مرکز کمتر و در نتیجه زمان بیشتر سانتریفوژ را خواهند داشت. در حین چرخش روتورهای زاویه متغیر، هنگامی‌که لوله در حالت افقی باشد، ذرات معلق بر اثر نیروی گریز از مرکز به انتهای لوله رانده شده و رسوب به صورت یک لایه‌ی تقریباً یکنواخت در ته لوله تشکیل می‌گردد. در پایان عمل لوله‌های حاوی نمونه مجدداً به حالت عمودی درآمده، رسوب در ته لوله و محلول شفاف در بالای آن قرار می‌گیرد. برای کاربر جمع‌آوری این رسوب‌ها نسبت به رسوب‌های تشکیل شده در دیواره‌های لوله آسان‌تر می‌باشد.