آشنایی با اصول آماده سازی محیط کشت آزمایشگاهی

محیط کشت یک ابزار اساسی در میکروبیولوژی تشخیصی است. امروزه بسیاری از محیط کشت‌های آزمایشگاهی به صورت تجاری در دسترس هستند. با این وجود، هنوز هم بسیاری از آزمایشگاه‌ها ترجیح می‌دهند که خودشان این محیط‌های کشت را آماده کنند. به همین دلیل در این مقاله قصد داریم به بررسی نحوه آماده سازی محیط کشت در آزمایشگاه بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

الف/ انتخاب صحیح محیط کشت و سازنده آن

اولین قدم برای آماده سازی محیط کشت، انتخاب یک محیط کشت با کیفیت از یک سازنده معتبر است. هنگام انتخاب محیط کشت، به دنبال محصولات معتبر باشید که توسط آزمایشگاه مرجع ملی تایید شده باشند. نام محصول، ترکیبات، دستورالعمل استفاده و ماندگاری محصول را به دقت بررسی کنید. به دنبال بسته بندی مقاوم در برابر رطوبت باشید.

همچنین توجه داشته باشید که برای کشت ارگانیسم‌های مختلف، به محیط کشت‌های متفاوتی نیاز است. پس اگر مطمئن نیستید که کدام محیط کشت مناسب آزمایش شما است، از یک فرد با تجربه‌تر سوال کنید.

در مورد شرایط نگهداری محیط کشت، همیشه از دستورالعمل‌های سازنده پیروی کنید. به عنوان مثال، مکمل‌های رشد مانند زرده تخم مرغ یا محلول‌های آنتی‌بیوتیک باید در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد نگهداری شوند. در حالی که محیط پایه ممکن است در دمای اتاق و حداکثر 30 درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.

همچنین توجه داشته باشید که ماندگاری پودر خشک شده معمولا چندین سال است. اما محیط‌های دهیدراته آب را جذب می‌کنند و به سرعت در معرض رطوبت خراب می‌شوند. با قرار گرفتن این محیط کشت‌ها در معرض رطوبت، توده سختی تشکیل می‌شود که خواص شیمیایی و میکروبیولوژیکی محیط را تغییر می‌دهد. این می‌تواند یک مشکل جدی برای شهرهای گرمسیری با آب و هوای مرطوب باشد. توصیه می‌شود تاریخ باز شدن درب محیط کشت را روی ظرف یادداشت کنید و محصول را حداکثر تا 6 ماه پس از باز کردن استفاده کنید.

ب/ لوازم مورد نیاز برای آماده سازی محیط کشت

در ادامه به بررسی تجهیزات مورد نیاز برای آماده سازی محیط کشت و مراحل انجام این کار خواهیم پرداخت.

۱.  مواد و تجهیزات مورد نیاز

• ارلن
• هات پلیت
• ورقه‌ی آلومینیومی
• دستگاه توزین (ترازو)
• محیط کشت
• کاردک
• استوانه مدرج
• آب مقطر یا دیونیزه
• اتوکلاو
• پتری دیش استریل
• دماسنج مادون قرمز

۲. محاسبه و توزین مواد تشکیل دهنده محیط کشت

یکی از بخش‌های مهم در آماده‌سازی محیط کشت ، توزین آن است. مواد تشکیل دهنده محیط کشت باید به صورت دقیق وزن شده و با یکدیگر مخلوط شوند. در غیر این صورت، محیط کشت کیفیت لازم را نخواهد داشت. محیط خشک شده باید در محیطی بدون رطوبت (رطوبت کم)، ترجیحاً در زیر هود آزمایشگاهی محاسبه و توزین شود. اطمینان حاصل کنید که میز، ترازو و تجهیزات تمیز و بدون گرد و غبار هستند.

برای آماده سازی محیط کشت و توزین دقیق مواد تشکیل دهنده آن به نکات زیر توجه کنید:

• ترازو را روی یک میز صاف، پایدار و بدون لرزش قرار دهید. دقت داشته باشید که ترازو باید در فواصل منظم کالیبره شود.
• برای جلوگیری از خطر استنشاق ذرات ریز، هنگام کار با محیط‌های کم آب از ماسک استفاده کنید.
• برای جلوگیری از تماس محیط کشت با پوست دستکش بپوشید. برخی از مواد تشکیل دهنده محیط کشت ممکن است باعث باعث تحریک پوست و چشم شوند.
• نام محصول، شماره قطعه، تاریخ آماده سازی، وزن و حجم آب و کد شناسایی اپراتور را ثبت کنید.
• برای سهولت توزین، از موادی با حجم از پیش تعریف شده استفاده کنید. در ظرف را باز کنید و مقدار لازم از پودر محیط کشت را بردارید. بلافاصله در ظرف را ببندید تا رطوبت به آن نفوذ نکند. به هیچ عنوان، پودر اضافی را دوباره داخل بطری قرار ندهید.

۳. اختلاط محیط کشت با آب و حرارت

یکی دیگر از مراحل مهم در آماده سازی محیط کشت، انحلال پودر در مایع است. در اغلب موارد لازم است برای حل شدن پودر در آب، محیط کشت جوشانده شود. با این وجود پیش از هر چیز حتما دستورالعمل‌های سازنده را بررسی کنید.

توصیه می‌شود از آب شیرین تهیه شده از طریق تقطیر، دییونیزاسیون یا اسمز معکوس استفاده کنید. وجود یون‌های در آب، رسانایی بالا و pH بالا ممکن است به طور قابل توجهی کیفیت محیط‌های آماده شده را تغییر دهد. از آب لوله کشی استفاده نکنید زیرا بر pH تأثیر می‌گذارد.

برای آماده سازی محیط کشت و انحلال آن در آب به نکات زیر توجه کنید:

• نصف آب مورد نیاز را داخل ارلن بریزید. پودر از قبل وزن شده را اضافه کنید. پیش گرم کردن آب تا دمای 50 الی 60 درجه سانتیگراد ممکن است انحلال را تسهیل کند.
• توصیه می‌شود از هات پلیت استفاده کنید تا انحلال با سرعتی ملایم و یکنواخت صورت گیرد.
• مابقی آب را به گونه‌ای درون ظرف اضافه کنید تا پودر اضافی چسبیده به دیواره ارلن حل شود. دقت داشته باشید که پودرهای باقی مانده روی دیواره داخلی ارلن ممکن است حین اتوکلاو کردن استریل نشوند. به این ترتیب در نتایج آزمایش اختلال ایجاد خواهد شد.
• هم زدن محلول باید تا جایی ادامه یابد که کاملا شفاف شود. از جوشاندن، گرم شدن بیش از حد و کف کردن محیط کشت خودداری کنید.

۴. استریل کردن، یک مرحله مهم در آماده سازی محیط کشت

یکی از مراحل مهم در آماده سازی محیط کشت ، استریل کردن آن است. اغلب محیط کشت‌های آزمایشگاهی پس از آماده سازی، درون دستگاه اتوکلاو یا بن ماری استریل می‌شوند. به این ترتیب فقط میکروارگانیسم‌های موجود در نمونه‌های بالینی رشد می‌کنند. نه آلاینده‌های آب یا محیط‌های پودری. البته توجه داشته باشید که برخی از محیط کشت‌ها را نمی‌توان اتوکلاو نمود. (مانند SS آگار، کری بلر آگار). پس حتما برای استریل کردن محیط کشت، به دستورالعمل‌های سازنده توجه کنید.

نکات مهم حین استریل کردن محیط کشت

برای استریل کردن محیط کشت آزمایشگاهی به نکات زیر توجه کنید:

• قبل از استریل کردن، محیط‌های مایع در لوله‌ها یا بطری‌‌های جداگانه توزیع کنید. محیط کشت باید زمانی استریل شود که کاملا به صورت محلول باشد.
• درب ظروف را کاملا سفت نکنید.
• زمان استریلیزاسیون به وسیله اتوکلاو باید از لحظه‌ای که دما به 121 درجه سانتیگراد می‌رسد شروع شود. اتوکلاو کردن معمولاً حداقل به 15 دقیقه زمان نیاز دارد. توجه داشته باشید که استریلیزاسیون بیش از حد باعث تغییر pH و تخریب اجزای محیط کشت می‌شود.
• حجم محیط کشت طی استریلیزاسیون باید کم باشد. در حالت ایده‌آل، تنها دو لیتر باید در یک زمان اتوکلاو شود.
• برای نظارت بر عملکرد صحیح اتوکلاو باید از شاخص‌های استریلیزاسیون مانند تست بووی دیک و شاخص‌های بیولوژیکی مانند اسپور Bacillus stearothermophilus استفاده شود.
• پس از تکمیل چرخه استریلیزاسیون، آگار مذاب قبل از توزیع در پتری دیش‌ها باید تا دمای 50 درجه سانتیگراد خنک ‌شود.
• در هر پتری دیش، حدود 20 تا 25 میلی‌لیتر آگار مذاب را بریزید.
• برای شناسایی اقلام استریل شده از نوار نشانگر برای برچسب زدن روی ارلن استفاده کنید.
• پس از پایان اتوکلاو شدن، قبل از باز کردن درب اتوکلاو کمی صبر کنید تا فشار به اندازه کافی کاهش یابد. در غیر این صورت ممکن است مایع بجوشد و بیرون بریزد.

تنظیم pH محیط کشت

یکی از نکات بسیار مهم در آماده سازی محیط کشت، تنظیم pH است. توجه داشته باشید که pH محیط کشت باید پس از استریلیزاسیون مشخص شود. قبل از توزیع محیط کشت (معمولاً در دمای 25 درجه سانتیگراد) pH محلول را به کمک یک pH‌متر بررسی کنید.

20 میلی لیتر از محلول را از ارلن خارج کنید، بگذارید خنک شود و pH را اندازه بگیرید.  pH را با محدوده pH مشخص شده در دستورالعمل سازنده مقایسه کنید. اگر pH مناسب است، به توزیع ادامه دهید. اما اگر انحرافی در مقدار pH مشاهده کردید، آب، ظروف و روش را بررسی کنید.

ج/ افزودن مکمل حین آماده سازی محیط کشت

گاهی اوقات لازم است به محیط کشت آزمایشگاهی یکسری مواد مکمل اضافه شود. این مواد می‌توانند رشد یکسری از میکروارگانیسم‌ها را متوقف کرده و رشد برخی دیگر را تسریع کنند. افزودن این مکمل‌ها به نوع آزمایش و میکروارگانیسم مشکوک بستگی دارد. پس حین آماده سازی محیط کشت، حتما به این موضوع نیز توجه داشته باشید.

اگر قرار است مواد دیگری به محیط کشت اضافه شود (مثلاً مکمل‌هایی مانند خون گوسفند یا ویتامین‌های خاص، مواد مغذی، محرک‌های رشد یا آنتی‌بیوتیک‌ها)، باید زمانی که آگار مذاب، سرد شده است، یعنی درست قبل از توزیع در پتری دیش‌ها، اضافه شوند.

نکات مهم برای افزودن مکمل به محیط کشت

• برای آماده سازی محیط کشت و حین افزودن مکمل‌ها، به نکات زیر توجه کنید.
• قبل از افزودن مکمل‌های حساس به حرارت، اجازه دهید محیط کشت تا دمای 45 الی50 درجه سانتیگراد خنک شود.
• اجازه دهید مکمل‌ها قبل از افزودن به دمای اتاق برسند.
• مکمل‌های استریل را به صورت آسپتیک اضافه کنید.
• از اختلاط کافی اطمینان حاصل کنید.
• برخی مواقع مکمل‌ها را نمی‌توان اتوکلاو نمود. مانند سرم، محلول‌های کربوهیدرات خاص، آنتی‌بیوتیک‌های خاص و سایر مواد حساس به حرارت. این مواد باید به طور جداگانه توسط فیلتراسیون غشایی استریل شوند. توجه داشته باشید که عبور محلول‌ها از فیلترهای غشایی با منافذ با قطر 0.2 تا 0.45 میکرومتر، ویروس‌ها را از بین نمی‌برد. اما به طور موثر اکثر آلاینده‌های باکتریایی و قارچی را از بین می‌برد.

د/ توزیع محلول پس از آماده سازی محیط کشت 

آخرین مرحله در آماده سازی محیط کشت، توزیع آن در ظروف است. قبل از توزیع محیط کشت اجازه دهید کمی خنک شود. (حدود 45 الی 50 درجه سانتیگراد). می‌توانید دما را با یک دماسنج مادون قرمز بررسی کنید. توجه داشته باشید که توزیع در دمای خیلی بالا منجر به تبخیر بیش از حد می‌شود.

نکات مهم برای توزیع محیط کشت

برای توزیع محیط کشت در پتری دیش یا لوله، به نکات زیر توجه کنید:

• از آب سرد برای خنک کردن آگار استفاده نکنید. زیرا ممکن است منجر به پوسته پوسته شدن یا تشکیل کدورت شود.
• اگر از پتری دیش‌هایی استفاده می‌کنید که قبلا استفاده شده‌اند، آن‌ها را در دمای 160 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت در فور با هوای گرم استریل کنید.
• برای جلوگیری از ترک خوردن ظروف شیشه‌ای، قبل از باز کردن درب فور، اجازه دهید فور تا دمای 50 درجه سانتیگراد خنک شود.
• محیط کشت‌ را به صورت آسپتیک در یک اتاق بدون جریان هوا (با پنجره های بسته) توزیع کنید. این کار باید به دور از پنکه یا پنجره یا هرجایی که جریان هوا وجود دارد انجام شود.
• توزیع محیط کشت را زیر هود ایمنی بیولوژیکی انجام دهید.

• قبل از توزیع، محیط کشت را با چرخاندن ارلن به آرامی مخلوط کنید. دهانه ارلن را به کمک شعله، استریل کنید. می‌توانید از پیپت‌های مدرج استریل یا سرنگ توزیع نیز استفاده کنید.
• برای آزمایش حساسیت ضد میکروبی، عمق آگار باید 0.5 ± 4 میلی‌متر باشد. پس حدود 25 میلی‌لیتراز محیط کشت را درون یک پتری دیش به قطر 90 میلی متر بریزید.
• دقت کنید که حباب هوا روی سطح آگار ایجاد نشود. برای از بین بردن آن می‌توانید از یک لوپ استریل استفاده کنید. لوپ را به کمک شعله استریل کنید.
• برای توزیع آگار یا محیط مایع در لوله، از لوله‌هایی با درپوش‌هایی استفاده کنید که اجازه تهویه هوا را می‌دهند (مثلاً درپوش‌های پیچی).
• برای تهیه اسلنت کالچر یا محیط کشت شیب‌دار، اجازه دهید آگار درون لوله در حالت شیب دار خشک شود.

ه/ بسته بندی و ذخیره سازی محیط کشت در آزمایشگاه

تا به اینجای مطلب در مورد نحوه آماده سازی محیط کشت در آزمایشگاه نکاتی را بیان کردیم. اما پس از آماده سازی نیز لازم است به یکسری نکات توجه کنید تا کیفیت محیط کشت شما حفظ شود. در ادامه به بررسی نکات مهم در ذخیره سازی و بسته بندی محیط‌های کشت خواهیم پرداخت.

۱. بسته بندی پتری دیش‌ها

روی هر پتری‌دیش، نام محیط کشت، تاریخ آماده سازی و شماره قطعه را درج کنید.

 برای جلوگیری از نفوذ رطوبت، پتری‌دیش‌ها را در کیسه‌های پلاستیکی مهر و موم شده و دارای برچسب، بپیچید. در هر کیسه حداکثر ده پتری دیش‌ وجود داشته باشد.

پتری دیش ها را به صورت وارونه و در دمای 2 الی 8 درجه سانتیگراد، در محلی تاریک نگهداری کنید. البته برای دمای نگهداری، حتما باید دستورالعمل سازنده را بررسی کنید.

توجه داشته باشید که ماندگاری محیط کشت های مختلف با یکدیگر متفاوت است. به طور مثال

نوترینت آگار بدون خون حدود 2 الی 4 هفته پایداری دارد. اما  آبگوشت سلنیت حدود ۲ تا ۳ ماه پایدار می‌ماند.

۲. کنترل کیفیت محیط کشت

در نهایت، همه تمامی محیط کشت‌های آزمایشگاهی، اعم از خریداری شده یا آماده شده، باید قبل از استفاده تحت کنترل کیفی دقیق قرار گیرند. کنترل کیفیت (QC) باید بر اساس یک رویکرد عملی و مبتنی بر ریسک باشد.

و/ استفاده از محیط کشت پس از آماده سازی

پس از آماده سازی محیط کشت و حین استفاده از آن نیز لازم است یکسری نکات را رعایت کنید.

قبل از استفاده، محیط کشت را به دمای اتاق برسانید.

اطمینان حاصل کنید که هیچ قطره آب قابل مشاهده‌ای روی سطح آگار یا داخل درب آن وجود ندارد. در صورت مشاهده، آب را از درب آن تکان ندهید. در عوض، پتری دیش را به مدت 20-30 دقیقه در دمای 35-37 درجه سانتیگراد خشک کنید. دقت کنید که پلیت را به صورت وارونه قرار دهید. پلیت را بیش از حد خشک نکنید. زیرا ممکن است روی سطح آگار ترک یا چروک ایجاد شود.

همچنین آگار را از لحاظ آلودگی نیز بررسی کنید. دقت کنید که رنگ آن کدر نشده باشد و هیچ گونه کلنی یا هرچیز غیر عادی روی آن مشاهده نشود.

برای دفع محیط‌های کشت استفاده شده، دستورالعمل های کشوری یا سازمان بهداشت جهانی را دنبال کنید. توصیه می‌شود محیط کشت غیرفعال شده و سوزانده شود. غیرفعال سازی باید در آزمایشگاه و ترجیحاً با اتوکلاو انجام شود.

رایج‌ترین خطاها حین آماده سازی محیط کشت

آماده سازی محیط کشت در آزمایشگاه می‌تواند بسیار چالش برانگیز باشد. عوامل بسیار مختلفی می‌توانند بر کیفیت محیط کشت تاثیر بگذارند. این امر مستقیما می‌تواند نتایج یک آزمایش را تحت تاثیر قرار دهد. تا به اینجای مطلب به بررسی روش آماده سازی محیط کشت در آزمایشگاه پرداختیم. اما در ادامه چند مورد از رایج‌ترین عوامل موثر در تغییر کیفیت محیط کشت را بررسی خواهیم کرد.

• کم آب بودن محیط کشت
• رطوبت بیش از حد هنگام ذخیره سازی
• باز بودن درب ظرف برای مدت طولانی
• pH اشتباه
• pH متر کالیبره نشده
• تأیید pH روی محیط خیلی داغ (به طور کلی باید در 25 درجه سانتی گراد انجام شود)
• استفاده از آب یا ظرف بی‌کیفیت
• استفاده از ظروف آلوده به مواد شیمیایی
• حلالیت ناقص
• استفاده از آب ناکافی
• ارلن خیلی کوچک است که اجازه اختلاط و همرفت کافی را نمی‌دهد
• تیره شدن، کاراملی شدن
• استریلیزاسیون بیش از حد
• ذوب مجدد مکرر
• نسبت نادرست محصول به آب: خطا در توزین یا رقیق شدن بیش از حد
• QC یا نگهداری نادرست

جمع بندی

همانطور که در بخش‌های قبلی گفته شد، آماده‌سازی محیط کشت در آزمایشگاه، یک کار بسیار چالش برانگیز است. هرگونه خطا حین این کار می‌تواند نتیجه یک آزمایش را مستقیما تحت تاثیر قرار دهد. این امر نه تنها موجب می‌شود آزمایشگاه هزینه‌های زیادی را متقبل شود. بلکه می‌تواند سلامت بیماران و جامعه را نیز تحت تاثیر قرار دهد. به همین دلیل آگاهی از نکات مهم در اماده‌سازی محیط کشت آزمایشگاهی بسیار حائز اهمیت است.

در این مطلب به مهم‌ترین نکات برای تهیه و نگهداری از محیط کشت آزمایشگاهی پرداختیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.