آزمایش مخمر و کپک در مواد غذایی

مخمرها (yeasts) و کپک‌ها (molds)، گروه بزرگ و متنوعی از میکروارگانیسم‌ها هستند که شامل صدها گونه می‌باشند. این موجودات توانایی بالایی برای فاسد کردن مواد غذایی دارند.

اگرچه اکثر مخمرها و کپک‌ها، هوازی اجباری هستند (یعنی برای رشد به اکسیژن آزاد نیاز دارند) اما نیاز اسیدی/ قلیایی آن‌ها برای رشد بسیار وسیع است و از 2= pH تا بیش از  9= pH متغیر است.

همچنین محدوده دمایی برای رشد و زنده ماندن این ارگانیسم‌ها، 10 تا 35 درجه سانتی‌گراد بوده و حتی برخی از گونه‌ها نیز قادر به رشد در زیر یا بالاتر از این محدوده دمایی هستند. با توجه به توانایی بالای قارچ‌ها و کپک‌ها برای آلوده کردن مواد غذایی، جای تعجب نیست که نحوه تشخیص آن ‌ها در آزمایشگاه‌های صنایع غذایی بسیار مورد توجه باشد. به همین دلیل در این مطلب به استناد از مطالب منتشر شده در سایت سازمان غذا و دارو آمریکا ^[1] (FDA) قصد داریم به بررسی آزمایش مخمر و کپک در مواد غذایی بپردازیم. پس در ادامه‌ی این مطلب با ما همراه باشید.

فهرست عناوین

۱. مخمر و کپک در مواد غذایی

۲. چرا آزمایش مخمر و کپک در مواد غذایی اهمیت دارد؟

۳. شمارش مخمر و کپک در مواد غذایی

‍۱-۳. تکنیک پلیت رقیق (dilution plating)

۱-۱-۳. تجهیزات و مواد

۲-۱-۳. معرف‌ها و محیط کشت

۳-۱-۳. مراحل تکنیک پلیت رقیق برای بررسی مخمر و کپک در مواد غذایی

۴-۱-۳. شمارش کلنی‌ها

۲-۳. تکنیک پلیت مستقیم (direct plating)

۱-۲-۳. تجهیزات و مواد

۲-۲-۳. معرف‌ها و محیط کشت

۳-۲-۳. تجزیه و تحلیل غذاهای ضد عفونی نشده سطحی

۴-۲-۳. تجزیه و تحلیل غذاهای ضد عفونی شده سطحی

۴. نحوه آماده‌سازی آگارها

۱-۴. دی کلران گلیسرول آگار (DG18)

۲-۴. آگار کلرامفنیکل بنگال دی کلوران-رز (DRBC)

۳-۴. مالت آگار (MA)

۴-۴. مالت اکسترکت آگار

۵. جمع‌بندی

۱. مخمر و کپک در مواد غذایی

مخمرها و کپک‌ها باعث درجات مختلفی از فساد و تجزیه مواد غذایی می‌شوند. مخمرها و کپک‌ها می‌توانند قبل از برداشت محصولات غذایی، حین فرآوری مواد غذایی و  یا زمان نگهداری مواد غذایی آن‌ها را آلوده کنند.

تشخیص مخمر و کپک در مواد غذایی، به نوع غذا، موجودات درگیر و درجه تهاجم بستگی دارد.

رشد مخمر و کپک در مواد غذایی با لکه‌های پوسیدگی در اندازه‌ها و رنگ‌های مختلف، دلمه‌های ناخوشایند، میسلیوم پنبه‌ای و سفید رنگ یا کپک هاگ‌زای رنگی آشکار می‌شود.  غذای آلوده ممکن است کمی لکه‌دار شود و یا کاملاً تجزیه شده باشد. طعم و بوی غیرعادی نیز ممکن است تولید شود.

۲. چرا آزمایش مخمر و کپک در مواد غذایی اهمیت دارد؟

گاهی اوقات ممکن است غذا بدون کپک به نظر برسد، اما پس از بررسی قارچ شناسی مشخص می‌شود که آلوده است. آلودگی مواد غذایی توسط مخمرها و کپک‌ها می‌تواند منجر به زیان اقتصادی قابل توجهی برای تولید کننده، فرآورنده و مصرف کننده شود.

کپک‌ها و مخمرهای موجود در مواد غذایی ممکن است برای سلامت انسان یا حیوانات خطرناک باشند زیرا توانایی تولید متابولیت‌های سمی به نام مایکوتوکسین‌ها (mycotoxins) را دارند. بیشتر مایکوتوکسین‌ها ترکیبات پایداری هستند که طی فرآوری غذا یا پخت و پز خانگی از بین نمی‌روند. به این معنا که حتی اگر موجودات مولد این سموم از بین بروند، سم از پیش ساخته شده ممکن است همچنان در مواد غذایی وجود داشته باشد.

برخی از کپک‌ها و مخمرهای موجود در مواد غذایی نیز ممکن است واکنش‌های آلرژیک ایجاد کنند یا باعث عفونت شوند. این خطر برای  افراد مسن و ضعیف، افراد آلوده به HIV، افرادی که به اختلالات سیستم ایمنی مبتلا هستند، کسانی که شیمی‌درمانی انجام می‌دهند و همچنین بیمارانی که آنتی بیوتیک مصرف می‌کنند بسیار بالا است.

جهت شناسایی مخمر و کپک در مواد غذایی، از دو روش  پلیت رقیق (dilution plating)  و پلیت مستقیم (direct plating) استفاده می‌شود.

برای شناسایی گونه‌های کپک منفرد که اغلب تولید سم می‌کنند، روش پلیت مستقیم کارآمدتر از روش پلیت رقیق است اما روش پلیت مستقیم در تشخیص مخمرها تاثیر کمتری دارد. روش پلیت مستقیم برای تعیین اینکه آیا وجود کپک به دلیل آلودگی خارجی یا تهاجم داخلی است نیز استفاده می‌شود.

در ادامه‌ی این مطلب قصد داریم به بررسی آزمایش‌های تشخیص کپک و مخمر در مواد غذایی بپردازیم.

۳. شمارش مخمر و کپک در مواد غذایی

۱-۳. تکنیک پلیت رقیق (dilution plating)

1-1-3. تجهیزات و مواد

• تجهیزات اساسی و تکنیک های مناسب برای تهیه هموژن نمونه
• تجهیزات برای آماده سازی پلیت حاوی نمونه مانند پتری دیش، پیپت، آگار و …
• انکوباتور 25 درجه سانتی‌گراد
• استریلایزر بخار
• pH متر
• بن‌ماری 1 ± 45 درجه سانتی‌گراد

2-1-3. معرف‌ها و محیط کشت

الف/ محیط کشت‌های مناسب

• آگار کلرامفنیکل بنگال دی کلوران-رز ^[2] (DRBC)
• آگار دی کلران گلیسرول 18% ^[3] (DG18)
• پلیت کانت آگار (PCA).

*توجه:  هنگامی که از این محیط کشت برای شمارش مخمر و کپک استفاده می‌شود، 100 میلی‌گرم کلرامفنیکل (chloramphenicol) به ازای هر لیتر اضافه کنید. این محیط کشت برای کپک‌های ” spreader” مناسب نیست.

• مالت آگار ^[4] (MA)
• مالت اکسترکت آگار ^[5]
• سیب زمینی دکستروز آگار ^[6] (PDA)، دهیتراته شده

نحوه آماده سازی محیط کشت در بخش 4 این مقاله بیان شده است.

ب/ محلول‌های آنتی بیوتیک

جهت بررسی مخمر و کپک در مواد غذایی، لازم است آنتی بیوتیک‌ها به محیط‌های قارچ شناسی اضافه ‌شوند تا رشد باکتری‌ها را مهار کنند. کلرامفنیکل (chloramphenicol) یک آنتی‌بیوتیک مناسب برای این کار است زیرا در شرایط اتوکلاو پایدار است. بنابراین آماده سازی محیط کشت به دلیل حذف مرحله فیلتراسیون آسان‌تر و سریع‌تر خواهد بود.

غلظت توصیه شده این آنتی بیوتیک 100 میلی‌گرم در لیتر است. اما اگر رشد بیش از حد باکتری‌ها آشکار شد، قبل از اتوکلاو، 50 میلی گرم در لیتر کلرامفنیکل به محیط اضافه کنید.

همچنین 50 میلی‌گرم در لیتر کلرتتراسایکلین (chlortetracycline) استریل شده با فیلتر را نیز درست قبل از انجام روش پور پلیت، به محیط کشت اضافه کنید.

نحوه آماده سازی محلول‌های آنتی بیوتیک

1. با حل کردن 1 گرم کلرامفنیکل در 40 میلی لیتر آب، محلول استوک را آماده کنید. این محلول را به 960 میلی لیتر از محیط کشت ​​اضافه کنید و سپس اتوکلاو کنید.

توجه داشته باشید که اگر قصد دارید علاوه‌بر کلرامفنیکل، کلرتتراسایکلین را نیز به محیط کشت خود اضافه کنید، باید 20 میلی لیتر از محلول کلرامفنیکل فوق را به 970 میلی لیتر محیط کشت اضافه کنید.

2. جهت آماده سازی استوک کلرتتراسایکلین 5 گرم از این آنتی بیوتیک را در 100 میلی لیتر آب مقطر حل کرده و محلول را فیلتر کنید. 10 میلی لیتر از این محلول را به 990 میلی لیتر از محیط کشت اتوکلاو شده اضافه کنید.
3. محیط کشت را در محیط تاریک یخچال قرار دهید. این محلول تا 1 ماه قابل استفاده است. توجه داشته باشید که محلول‌های استوک قبل از افزودن به محیط کشت باید به دمای محیط برسند.

۳-۱-۳. مراحل تکنیک پلیت رقیق برای بررسی مخمر و کپک در مواد غذایی

25 الی 50 گرم از نمونه مواد غذایی را برای انجام آزمایش انتخاب کنید.

الف/ روش اسپرید پلیت

• 0.1 میلی‌لیتر از نمونه‌ی رقیق شده را به صورت آسپتیک روی پتری دیش حاوی DRBC آگار ^[7] بریزید. توجه داشته باشید که آگار باید از قبل در پتری دیش ریخته و کاملا جامد شده باشد.
• نمونه را با استفاده از یک میله شیشه‌ای استریل و T شکل روی سطح آگار پخش کنید.
• در صورتی که واتر اکتیویته ^[8] یا فعالیت آب نمونه مورد آزمایش، کمتر از 95 باشد، توصیه می‌شود از آگار DG18ء^[9] استفاده گردد.

در مواد غذايي مختلف مقداري آب وجود دارد كه در واقع همان رطوبت ماده غذایی است. بخشي از اين آب جذب و چسبيده به مواد مي‌باشد كه اصطلاحاً  رطوبت درگير (Bound Water) نامیده می‌شود. بخـش ديگر از آب مـوجـود در مواد غذایی به‌صــورت آزاد (Unbound Water) که شاخص فعالیت آب یا واتراکتیویته می‌باشد.  واتراكتيويته نقـش بسـيار مـهمي در كيفيت مواد غذايي به‌خصوص زمان ماندگاري و فساد ناشي از رشد ميكروارگانيسم‌ها دارد.

• 3 پتری دیش آماده کنید.

ب/ روش پورپلیت

• 1 میلی لیتر از نمونه‌ی رقیق شده را به کمک اپلیکاتور روی پتری دیش تلقیح کنید. (ابعاد پتری دیش 15 × 100 میلی متر)
• بلافاصله 20 الی 25 میلی لیتر از آگار DG18 مذاب را اضافه کنید.
• پتری دیش را آرام در جهت عقربه‌های ساعت و برعکس بچرخانید تا محتویات درون آن مخلوط شود.
• دقت داشته باشید که آگار باید ظرف 1 الی 2 دقیقه پس از افزودن نمونه در پتری دیش ریخته شود. در غیر این صورت، ممکن است نمونه به کف ظرف بچسبد  و به طور یکنواخت با آگار مخلوط نشود. (مخصوصاً اگر نمونه حاوی نشاسته زیاد باشد و ظروف پلاستیکی باشند)
• پتری دیش‌ها را در تاریکی در دمای 25 درجه سانتی‌گراد انکوباسیون کنید.

 توجه:

• از تهیه اولین رقت نمونه تا آماده سازی پتری دیش نباید بیش از 20 دقیقه (ترجیحاً 10 دقیقه) زمان سپری شود.
• روش اسپرید پلیت بهتر از روش پورپلیت است زیرا هنگامی که از تکنیک پورپلیت استفاده می‌شود، کلنی‌های قارچی روی سطح سریع‌تر رشد می‌کنند و اغلب آن‌هایی را که در زیر سطح هستند پنهان می‌شوند. در نتیجه شمارش خیلی دقیق نخواهد بود.
• DRBC آگار باید فقط در تکنیک اسپرید پلیت استفاده شود.
• 3 پتری دیش آماده کنید.

۴-۱-۳ . شمارش کلنی‌ها

• شمارش کلنی باید پس از 5 روز انکوباسیون صورت گیرد. در صورت عدم رشد کلنی‌ها در 5 روز، مجدداً 48 ساعت دیگر پتری دیش‌ها را انکوباسیون کنید.
• قبل از پایان دوره انکوباسیون، کلنی‌ها را شمارش نکنید زیرا دست زدن به پتری دیش‌ها می‌تواند منجر به رشد هاگ‌ها شده و دقت شمارش را به خطر بیندازد.
• در صورتی که پتری دیش حاوی 10 الی 150 کلنی بود، شمارش را شروع کنید.
• نتایج را در واحدهای تشکیل کلنی (CFU)/g یا CFU/ml بر اساس میانگین تعداد مجموعه سه پتری دیش گزارش کنید.
• می‌توانید عدد به دست آمده را به صورت زیر رند کنید:
• اگر رقم سوم 6 یا بالاتر است، به سمت بالا گرد کنید (مثلاً 456 به460).
• اگر رقم سوم 4 یا کمتر است، به سمت پایین گرد کنید (به عنوان مثال، 454 به 450).
• اگر رقم سوم 5 است، اگر 2 رقم اول یک عدد زوج باشد، آن را سمت پایین گرد کنید (مثلاً 445 به 440).
• اگر 2 رقم اول یک عدد فرد باشد، به سمت بالا گرد کنید. (مثلاً 455 به 460)

در صورت نیاز به آزمایشات بیشتر و شناسایی گونه مخمر و کپک در مواد غذایی، کلنی‌های منفرد را روی آگار PDAء^[10] کشت دهید.

۲-۳. تکنیک پلیت مستقیم (direct plating)

از این روش جهت بررسی مواد غذایی استفاده می‌شود که با فورسپس قابل کنترل هستند (مانند لوبیا، آجیل، ادویه آسیاب نشده، دانه‌های قهوه، کاکائو و غیره)

۱-۲-۳. تجهیزات و مواد

• فریزر 20- درجه سانتی‌گراد
• بشر استریل، 300 میلی‌لیتری
• فورسپس استریل
• استریلایزر بخار
• بن‌ماری 1 ± 45 درجه سانتی‌گراد
• انکوباتور 25 درجه سانتی‌گراد

۲-۲-۳. معرف‌ها و محیط کشت

• آگار کلرامفنیکل بنگال دی کلوران-رز (DRBC)
• آگار دی کلران گلیسرول 18% (DG18)
• محلول‌های آنتی بیوتیک (به بخش قبل مراجعه کنید)
• محلول NaOCl (سفید کننده تجاری) 10%
• آب مقطر استریل

۳-۲-۳. تجزیه و تحلیل غذاهای ضد عفونی نشده سطحی ^[11]

الف/ آماده سازی نمونه

• • در قدم اول، نمونه را به مدت 72 ساعت در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگه دارید تا کنه‌ها و حشراتی که ممکن است در نتایج آزمایش اختلال ایجاد کنند، از بین بروند.
  • DRBC آگار را آماده کنید. اگر DRBC در دسترس نیست، یا فعالیت آبی (واتر اکتییوته) نمونه مورد آزمایش کمتر از 95 است، از آگار DG18 استفاده کنید.
  • توجه داشته باشید که آگارها باید حداکثر 24 ساعت پیش از انجام آزمایش آماده شده باشند و چنانچه زمان بیشتری از آماده‌سازی آن‌ها گذشته باشد، نباید مورد استفاده قرار گیرند.
  • حدود 50 گرم از نمونه را به یک بشر استریل 300 میلی لیتری منتقل کنید. با استفاده از فورسپس آغشته شده به اتانول 95% و حرارت دیده، نمونه را روی سطح آگار جامد شده قرار دهید. 5 الی 10 تکه از ماده غذایی در هر پتری دیش (بسته به اندازه ماده غذایی) کافی است.
  • هربار که می‌خواهید ماده غذایی را روی آگار قرار دهید، فورسپس را حرارت دهید. برای جلوگیری از اتلاف وقت و یا گرم شدن بیش از حد فورسپس، می‌توانید از چند فورسپس استفاده کنید.
  • مواد غذایی کپک زده یا لکه دار را روی آگار قرار ندهید.
  • 3 الی 5 پتری دیش آماده کنید. لیبل حاوی اطلاعات نمونه‌ها و تاریخ آماده سازی پتری دیش را روی هر ظرف بچسبانید.
  • ظروف را در تاریکی در دمای 25 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 روز انکوباسیون کنید. اگر در 5 روز انکوباسیون رشدی مشاهده نشد، 48 ساعت دیگر انکوباسیون را ادامه دهید تا سلول‌ها و هاگ‌ها زمان کافی برای رشد داشته باشند.

ب/ شمارش پتری دیش

پس از انکوباسیون و مشاهده رشد در پتری دیش‌ها، وقوع کپک را بر حسب درصد تعیین کنید. توجه داشته باشید که اگر تمام 50 ماده غذایی کپک زده باشد، میزان کپک زدگی 100٪ است.

یا اگر از 32 مورد از مواد غذایی قرار داده شده روی آگار کپک دیده شود، میزان کپک‌زدگی 64% خواهد بود.

آزمونگرانی که تجربه زیادی در فعالیت‌های آزمایشگاهی دارند، ممکن است با بررسی پتری دیش زیر میکروسکوپ (بزرگنمایی  10تا 30 برابر) گونه‌های آسپرژیلوس (Aspergillus)، پنی سیلیوم (Penicillium) و سایر کپک‌های موجود در مواد غذایی را مستقیماً شناسایی کنند.

۴-۲-۳. تجزیه و تحلیل غذاهای ضد عفونی شده سطحی ^[12]

• مواد غذایی را در سینک آزمایشگاهی تمیز (ترجیحا از جنس استیل نباشد) ضدعفونی کنید. توجه داشته باشید که سینک عاری از هر گونه باقیمانده اسید باشد.
• دستکش بپوشید و حدود 50 گرم نمونه را به یک بشر استریل 300 میلی لیتری منتقل کنید.
• محلول کلر 10% را روی مواد غذایی بریزید و اجازه دهید 2 دقیقه روی مواد غذایی باقی بماند. در این مدت زمان، محتویات داخل بشر را به‌آرامی اما به‌طور مداوم در جهت عقربه‌های ساعت و خلاف جهت بچرخانید تا کاملا ضدعفونی شوند.
• کلر 10%را تخلیه کنید و محتویات بشر را 1 دقیقه با آب مقطر استریل بشویید.
• آماده سازی پتری دیش‌ها و شرایط انکوباسیون نمونه دقیقا مشابه با قسمت قبل (3-3-3) است.
• نتایج تجزیه و تحلیل غذاهای ضد عفونی شده سطحی و ضدعفونی نشده را با یکدیگر مقایسه کنید تا مشخص شود که آیا کپک زدگی عمدتاً به دلیل آلودگی سطحی است یا به تهاجم و رشد میکروارگانیسم در داخل نمونه ربط دارد.

۴. نحوه آماده‌سازی آگارها

۱-۴. دی کلران گلیسرول آگار (DG18)

مواد فوق را مخلوط کرده و روی بخار آب قرار دهید تا آگار حل شود، سپس حجم آن را با افزودن آب مقطر به 1000 میلی لیتر برسانید.

220 گرم گلیسرول (گرید آزمایشگاهی) را به مواد فوق اضافه کنید و محلول را در دمای 121 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو کنید.

دمای محیط کشت را به 45 درجه سانتی‌گراد برسانید و آن را در پتری دیش‌های استریل بریزید.

۲-۴. آگار کلرامفنیکل بنگال دی کلوران-رز (DRBC)

pH نهایی باید 5.6 باشد

جهت آماده‌سازی محیط کشت، مواد فوق را مخلوط کرده، حرارت دهید تا آگار حل شود.

سپس محلول را در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو کنید.

محلول را در بن‌ماری قرار دهید تا دمای آن به 1 ± 45 درجه سانتی‌گراد برسد و سپس آن را درون پتری دیش‌ها بریزید.

توجه:

1. DRBC آگار برای تجزیه و تحلیل نمونه‌های حاوی کپک (مانند Mucor، Rhizopus و غیره) مفید است. زیرا دی کلران و رز بنگال رشد قارچ‌های سریع رشد را کاهش داده و به راحتی امکان تشخیص مخمرهای دیگر را فراهم می‌کنند.
2. محیط‌ کشت‌های حاوی رز بنگال به نور حساس هستند. قرار گرفتن این محیط کشت در معرض نور (حتی برای زمانی کوتاه) منجر به تشکیل ترکیبات بازدارنده می‌شود.

۳-۴. مالت آگار (MA)

مواد را مخلوط کنید و روی بخار آب قرار دهید تا آگار حل شود. سپس محلول را به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی‌گراد اتوکلاو کنید.

 محیط کشت را به دمای 45 درجه سانتی‌گراد برسانید و آن را درون پتری دیش‌ها بریزید.

 برای تهیه اسلنت کالچر (slant culture)، 5 تا 6 میلی‌لیتر از محیط را (قبل از اتوکلاو کردن) در هر یک از لوله‌های 100 × 16 بریزید. درب لوله ها را به صورت شل ببندید و محیط کشت را اتوکلاو کنید.

 پس از اتوکلاو، لوله‌ها را در حالت اریب قرار دهید و بگذارید خنک شوند.

۴-۴. مالت اکسترکت آگار

مواد فوق را مخلوط کرده، حرارت دهید تا آگار حل شود و در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو کنید.

دمای محیط کشت را به 45 درجه سانتی‌گراد برسانید و آن را در ظروف پتری دیش بریزید. این محیط کشت دهیدراته به صورت تجاری در دسترس است. اما از آنجایی که فرمول‌های مختلفی از این محیط کشت وجود دارد، پیش از خرید، ترکیب مناسب را بررسی کنید. این محیط برای شناسایی آسپرژیلوس (Aspergillus) و پنی سیلیوم (Penicillium) توصیه می‌شود.

جمع‌بندی

همانطور که در قسمت مقدمه نیز گفته شد، مخمرها و کپک‌ها، ارگانیسم‌هایی هستند که در شرایط مختلف مقاوم بوده و به همین دلیل تاثیر بسزایی در فساد مواد غذایی دارند. از همین رو آزمایش مخمر و کپک در مواد غذایی یکی از مشائل بسیار مهم در صنعت تولید و فراوری غذا است. در این مطلب سعی کردیم تا روش‌های مورد استفاده برای آزمایش مخمر و کپک در مواد غذایی را بیان کنیم. توجه داشته باشید که روش‌های گفته شده به استناد از مطالب سازمان غذا و داروی آمریکا نگارش شده‌اند و ممکن است شما در آزمایشگاه خود، بنابر قوانین ملی یا پروتکل‌های آزمایشگاهی از روش‌های مختلفی استفاده کنید.

امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.

واژه‌نامه: