تهیه‌ی رقت‌های سریالی: تعریف، روش و کاربرد
باکتری‌شناسی یکی از حوزه‌های مهم آزمایشگاهی است که در تشخیص بیماری‌های زیادی کاربرد دارد. گاهی اوقات علاوه بر شناسایی باکتری لازم است تا تعداد آن نیز در واحد حجم شمارش شود. به این منظور اغلب اوقات تهیه رقت‌های سریالی از نمونه امری ضروری است.
اگر کاربر آزمایشگاهی هستید و یا در این حوزه تحصیل می‌کنید ممکن است در ساخت رقت‌های سریالی با مشکلاتی مواجه شده باشید. با خواندن ادامه این مطلب در ادامه با تعریف، روش و کاربرد تهیه‌ی رقت‌های سریالی آشنا خواهید شد. پس در ادامه با ما همراه باشید.
رقت‌های سریالی چیست؟
رقت‌هالی سریالی، همانطور که از نامشان پیدا است، محلول‌های کمتر متراکم یا کمتر غلیظِ ایجاد شده از یک محلول بسیار متراکم یا غلیظ هستند. به زبان ساده‌تر، رقت سریالی یک روش آزمایشگاهی است که در آن یک فرآیند رقتِ گام به گام بر روی یک محلول، با یک عامل رقت مرتبط انجام می‌شود. در آزمایشگاه‌ها، از این روش برای کاهش تعداد سلولها در یک محیط کشت استفاده می‌شود تا عمل بررسی و تشخیص میکروارگانیسم‌های موجود در نمونه ساده‌تر شود.
در رقت‌های سریالی، تعداد سلول یا تراکم سلول به تدریج با افزایش تعداد سریال‌ها در هر مرحله کاهش می‌یابد.
تهیه‌ی رقت‌های سریالی چه اهمیتی دارد؟
هدف اصلی از تهیه‌ی رقت‌های سریالی این است که غلظت یا تعداد سلول‌های یک نمونه‌ی ناشناس را با شمارش تعداد کلنی‌هایی که از کشت رقت‌های سریالی نمونه حاصل می‌شوند را، دریابید.
با انکوباسیون کردن رقت‌های سریالی، کلنی‌هایی که به راحتی قابل شمارش هستند تولید می‌شوند، از این رو می توان تعداد سلول‌های موجود در نمونه را به راحتی شمرد.
کاربرد روش رقت سریالی
رقت سریالی یک روش آزمایشگاهی پرکاربرد برای علوم تجربی مانند داروشناسی، بیوشیمی، هومئوپاتی و فیزیک است.
در یک آزمایشگاه میکروبیولوژی، تهیه رقت‌های سریالی برای تعیین تراکم یا تعداد سلولها یا موجودات زنده در یک نمونه ناشناخته و ایجاد پلیت‌هایی با تعدادِ قابل شمارش کلنی استفاده می‌شود.
در آزمایشگاه‌های بیوشیمی از این تکنیک برای دستیابی به غلظت مناسبی از واکنش دهنده‌ها و مواد شیمیایی با چگالی بالا استفاده می‌شود.
در آزمایشگاه‌های دارویی از رقت سریالی برای به‌دست آوردن غلظت مورد نیاز مواد شیمیایی و ترکیبات در داروها استفاده می‌شود زیرا این روش از رقت‌های منفرد کارآمدتر است.
رقت‌های هومئوپاتی نیز در مواردی استفاده می‌شوند که لازم باشد ماده‌ای درون آب مقطر یا الکل رقیق شود.
مراحل آماده‌سازی رقت‌های سریالی
جهت تهیه رقت‌های سریالی، نمونه‌ی انتخاب شده با افزودن حجم استانداردی از رقیق کننده‌های استریل، مانند آب مقطر یا سالین ۰/۹ درصد رقیق می‌شود. سپس مقدار کمی نمونه از هریک از رقت‌های آماده شده روی پلیت‌های حاوی آگار کشت داده می‌شوند.
در ادامه مراحل آماده سازی رقت سریالی ۱۰ (ten-fold) در یک نمونه را با فاکتور رقت ۶:۱۰ را توضیح خواهیم داد.
۱. شش لوله آزمایش استریل و تمیز بردارید.
۲. شش لوله را با ۹ میلی لیتر رقیق کننده استریل مانند آب مقطر یا سالین ۰/۹ درصد پر کنید.
۳. با استفاده از پیپت پاستور، ۱ میلی‌لیتر از نمونه را مکش کنید. نمونه را درون لوله‌ی اول ریخته و آن را با عامل رقت موجود در لوله مخلوط کنید. در صورت لزوم می‌توانید از یک ورتکس میکسر استفاده کنید. حجم کلی لوله باید ۱۰ میلی لیتر باشد. ضریب رقت اولیه ۱:۱۰ است. اطمینان حاصل کنید که در حین انتقال، نوک پیپت پاستور به دیواره لوله آزمایش تماس پیدا نکند یا هیچ مقدار از نمونه در آن باقی نماند.
۴. با استفاده از پیپت پاستور ۱ میلی‌لیتر از نمونه‌ی موجود در لوله اول را به لوله دوم منتقل کنید.
۵. این مراحل را برای ۴ لوله‌ی باقی مانده تکرار کنید.
۶. رقت باکتری یا سلول در آخرین لوله آزمایش ۶:۱۰ خواهد بود (1 در 1،000،000)
فرمول و محاسبات برای تهیه رقت‌های سریالی
میزان عامل رقت (dilution factor) یا تعداد رقت‌های سریالی بر اساس میزان غلظت سلول‌های موجود در نمونه‌ی مورد نظر افزایش می‌یابد. به عنوان مثال، اگر نمونه‌ای از منبع بسیار آلوده جمع‌آوری شود، فاکتور رقت افزایش می‌یابد. در مقابل، اگر منبع نمونه کمتر آلوده باشد، یک فاکتور رقت کم کافی است.
در آزمایشگاه‌ها از رقت 2 (two-fold) و 10 (ten-fold) برای تیتراسیون آنتی‌بادی‌ها یا تهیه آنالیت‌های رقیق استفاده می‌شود. در روش رقت سریالی، ضریب رقت را می‌توان برای یک لوله آزمایش واحد یا برای کل سری (فاکتور رقت کل) محاسبه کرد.
عامل رقت برای یک لوله از تقسیم حجم اولیه بر حجم نهایی محاسبه می‌شود:
که در آن:
Vi : حجم اولیه نمونه
Vf: حجم نهایی مورد نظر
مثال: اگر ۱ میلی‌لیتر از نمونه به ۹ میلی‌لیتر از ماده رقیق کننده افزوده شود تا حجم نهایی محلول ۱۰ میلی‌لیتر باشد، فاکتور رقت به صورت زیر خواهد بود
مثال: اگر ۰/۲ میلی لیتر محلول استوک را به ۳/۸ میلی لیتر ماده رقیق کننده اضافه کنیم، ضریب رقت به صورت زیر محاسبه خواهد شد:
به یاد داشته باشید که رقت‌های سریالی همیشه با گرفتن مقدار مشخصی از رقت اولیه و افزودن متوالی آن به لوله‌هایی با همان حجم، ساخته می‌شوند. بنابراین نحوه‌ی محاسبه‌ی فاکتور رقت کل به صورت زیر خواهد بود:
فاکتور رقت کل: رقت قبلی × رقت لوله بعدی
مثال: فرض کنید میخواهید ۰/۲ میلی لیتر از یک نمونه که غلظت آن ۱۰۰ میکروگرم در میکرولیتر است را به ۳/۸ میلی لیتر ماده رقیق کننده در لوله ۲ منتقل کرده و مخلوط کنید. سپس ۰/۲ میلی‌لیتر از نمونه‌ی موجود در لوله‌ی ۲ را به ۳/۸ میلی لیتر ماده رقیق کننده در لوله ۳ منتقل کرده و مخلوط کنید و این کار را تا جایی تکرار کنید که ۴ لوله داشته باشید. در این صورت فاکتور رقت به صورت زیر قابل محاسبه خواهد بود:
فاکتور رقت در لوله اول:
فاکتور رقت کل:
اگر غلظت محلول اصلی ۱۰۰ میکروگرم در میکرولیتر بوده باشد ، غلظت نمونه در لوله ۴ به صورت زیر قابل محاسبه است:
محدودیت‌های تهیه رقت‌های سریالی
همانطور که گفته شد تهیه رقت‌های سریالی یکی از تکنیک‌های پرکاربرد در آزمایشگاه‌های مختلف است. اما گاهی اوقات این تکنیک به کابوسی برای کارکنان آزمایشگاه تبدیل می‌شود. از جمله مشکلاتی که کاربران آزمایشگاه حین تهیه رقت‌های سریالی با آن روبه رو هستند می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:
- ممکن است در طول توزیع نمونه یک اشتباه رخ دهد و خطاهای انتقال منجر به کارایی کمتر رقت‌های آماده شده گردد.
- این کار به صورت مرحله‌ای انجام می‌شود، به همین دلیل به مدت زمان طولانی‌تری نیاز دارد.
- این روش فقط تعداد باکتری‌ها یا سلولها را کاهش می‌دهد اما مانند روش‌های دیگری مثل فلوسیتومتری قادر به جداسازی سلولها نیست.
- برای انجام این روش به متخصصان آموزش دیده نیاز است.
جمع‌بندی
تهیه رقت‌های سریالی یک تکنیک پرکاربرد در آزمایشگاه‌های مختلف محسوب می‌شود که مستلزم دقت، مهارت و صرف زمان و حوصله است. به همین دلیل ممکن است این کار برای کارکنان آزمایشگاهی کمی دشوار باشد. اما باید توجه داشت که انجام آزمایش‌ها به ویژه در حوزه دارویی و تشخیص طبی با جان انسان‌های زیادی مرتبط است و لذا نیاز به دقت و حوصله‌ی بالایی دارد. در این مطلب سعی کردیم تا در رابطه با تهیه رقت‌های سریالی و اهمیت و کاربرد آن در آزمایشگاه اطلاعاتی ارائه کنیم. خوشحال می‌شویم تجربیات استفاده از این تکنیک را با ما و دیگر خوانندگان این مطلب به اشتراک بگذارید.
