رنگ آمیزی کالکوفلور سفید : اصول، روش و کاربردها

رنگ‌آمیزی سلول‌های قارچی‌، بخش مهمی از فعالیت‌های میکروبیولوژی را به خود اختصاص داده است. تکنیک رنگ آمیزی کالکوفلور سفید (Calcofluor white) یکی از روش‌هایی است که برای رنگ‌آمیزی قارچ‌ها در آزمایشگاه مورد استفاده قرار می‌گیرد. به همین دلیل در این مطلب قصد داریم به بررسی این روش و اصول و کاربردهای آن بپردازیم.

آیا شما هم جزء کاربرانی هستید که رنگ‌آمیزی نمونه در آزمایشگاه را بر عهده دارید؟ پس این مطلب بدون شک برایتان مفید خواهد بود. در ادامه با ما همراه باشید.

اما پیش از آن به ما بگویید که شما در آزمایشگاه خود از چه روشی برای رنگ آمیزی قارچ‌ها استفاده می‌کنید؟

برای آشنایی با تکنیک‌های مختلف رنگ‌آمیزی قارچ، کلیک کنید.

رنگ‌ آمیزی قارچ‌ها در آزمایشگاه

در رنگ‌آمیزی کالکوفلور سفید از رنگ‌های فلورسنت برای رنگ‌آمیزی کیتین و سلولز موجود در دیواره سلولی قارچ‌ها، گیاهان و جلبک‌ها استفاده می‌شود. کالکوفلور به کیتین و سلولز متصل می‌شود. به این ترتیب می‌توان اجزای نمونه را زیر میکروسکوپ بررسی نمود.

در گذشته، رنگ‌آمیزی KOH روشی رایج برای بررسی مستقیم نمونه‌های قارچی در آزمایشگاه بود. اما این روش حساسیت کمی دارد و نمی‌تواند هیف‌ها را از الیاف کلاژن متمایز کند. به همین دلیل امروزه تکنیک رنگ آمیزی کالکوفلور سفید روش رایج‌تری است.

البته گاهی اوقات ممکن است از ترکیب این دو روش برای بررسی نمونه‌های مشکوک به قارچ استفاده شود. به عبارت دیگر،  هنگامی که رنگ آمیزی کالکوفلور سفید با KOH ترکیب می‌شود، رنگ سفید کالکوفلور حساسیت بهتری برای شناسایی قارچ‌ها در نمونه بالینی ایجاد می‌کند.

کاربرد رنگ آمیزی کالکوفلور سفید

تکنیک رنگ آمیزی کالکوفلور سفید یکی از روش‌هایی است که اغلب برای تشخیص سریع عفونت‌‌های قارچی استفاده می‌شود. برخی از کاربردهای این روش رنگ آمیزی در ادامه مطرح شده‌اند.

• کالکوفلور سفید یک رنگ حساس است که به تجسم هیف‌ها، شبه هیف‌ها و مخمر کمک می‌کند. از آنجایی که غلظت کیتین در مخمرهای جوانه زده بیشتر است، کلکوفلور وایت جوانه را با شدت بیشتری رنگ‌دار می‌کند.
• کالکوفلور سفید در تشخیص قارچ غیرقابل کشت مانند Pneumocystis jirovecii کاربرد زیادی دارد.
• تکنیک رنگ آمیزی کالکوفلور سفید می تواند برای مشاهده عوامل غیر قارچی مانند آمیب‌های آزاد (آکانتاموبا، ناگلریا و بالاموتیا) و لارو دیروفیلاریا قابل استفاده باشد. این تکنیک به تشخیص سریع کراتیت آکانتاموبا از قرنیه و نمونه‌های کراتکتومی کمک می کند.

• کالکوفلور سفید سلول‌های رویشی (vegetative cells) را رنگ‌آمیزی می‌کند. اما آسکوسپورها (ascospores) را رنگ نمی‌کند. بنابراین، اگر نمونه حاوی آسکوسپورها باشد، این تکنیک رنگ‌آمیزی به تمایز کمک خواهد کرد.

اصول رنگ‌آمیزی کالکوفلور سفید

کالکوفلور سفید (CFW) یک رنگ محلول در آب، بی رنگ و سفید کننده فلورسنت است. این رنگ در صنعت نساجی و کاغذ نیز استفاده می‌شود. هنگامی که CFW با نمونه‌های بالینی تماس پیدا می‌کند، در صورت وجود عناصر قارچی، به پلی ساکاریدهای ۱-۳ beta و ۱-۴ beta متصل می‌شود. سپس با قرار گرفتن در معرض نور ماوراء بنفش به رنگ سبز تبدیل می‌شود. این امر زیر میکروسکوپ فلورسنت قابل مشاهده است.

طی مشاهدات میکروسکوپی فلورسنت، قارچ‌ها، رنگ سبز درخشان را فلورسانس می‌کنند. سایر عناصر موجود در نمونه به صورت قرمز مایل به نارنجی فلورسانس خواهند شد.

آبی ایوانز (Evans blue ) نیز حین رنگ‌آمیزی کالکوفلور سفید به عنوان یک ضد لکه استفاده می‌شود. این رنگ با استفاده از تحریک نور آبی (نه UV) فلورسانس پس زمینه را کاهش می‌دهد. افزودن ۰٫۱ درصد رنگ آبی ایوانز،  فلورسانس غیر اختصاصی پس زمینه را به حداقل می‌رساند. این رنگ همچنین زمینه متضاد نارنجی تا قرمز یاقوتی را ایجاد می‌کند و به نشان دادن واضح قارچ‌ها در بافت اطراف کمک می‌کند.

نحوه آماده‌سازی کالکوفلور سفید

تکنیک رنگ‌آمیزی کالکوفلور سفید نیازمند پودر سفید کالکوفلور است که در آب مقطر حل می‌شود. برای تهیه ۱% از رنگ کلکوفلور سفید ، لازم است ۱ گرم  از پودر آن در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل شود. این محلول باید در دمای اتاق نگهدای شود.  توصیه می‌شود کالکوفلور سفید را در محل تاریک نگهداری کنید. به این ترتیب می‌توان مدت زمان بیشتری از آن استفاده نمود.

مراحل رنگ آمیزی کالکوفلور سفید

• ابتدا یک لام شیشه‌ای تمیز و بدون چربی بردارید و مقداری از نمونه را در مرکز آن قرار دهید.
• سپس یک قطره رنگ کالکوفلور سفید را روی نموه بریزید. می‌توانید محلول آبی ایوانز را نیز به آن اضافه کنید.
• برای بررسی بهتر نمونه، محلول KOH 10%را روی لام بریزید.
• سپس لامل را روی لام قرار دهید و اجازه دهید یک دقیقه بماند.
• پس از آن، لام را زیر نور UV با بزرگنمایی ۱۰۰X الی ۴۰۰X مشاهده کنید.

نتیجه و تفسیر تکنیک رنگ آمیزی کالکوفلور سفید

برای بررسی نتایج حاصل از رنگ آمیزی کالکوفلور سفید ، به شکل ۱ مراجعه نمایید.

• بخش A: رنگ کالکوفلور سفید ادرار نشان دهنده کاندیدا آلبیکنس است.
• بخش B: رنگ آمیزی کالکوفلور سفید پنوموسیستیس در نمونه برونکوآلوئولار لاواژ (BAL)
• بخش C: رنگ آمیزی کالکوفلور سفید خلط که سلول‌های مخمر داخل سلولی هیستوپلاسما کپسولاتوم را نشان می‌دهد.

به طور کلی اگر نمونه‌ی رنگ‌آمیزی شده با کالکوفلور سفید حاوی عناصر قارچی باشد، می‌توان آن‌ها را زیر میکروسکوپ به صورت زیر مشاهده نمود.

قارچ‌ها و انگل‌ها به رنگ سبز و سایر عناصر به رنگ قرمز مایل به نارنجی مشاده می‌شوند.

الیاف پنبه شدیدتر از هیف‌های قارچی فلورسانس می‌شوند، بنابراین باید آن‌ها را با دقت مشاهده کرد.

در آمیب‌ها، تروفوزوئیت فلورسانس می‌شود، اما کیست‌ها مشخص نمی‌شوند.

کیست‌های پنوموسیستیس به صورت یک سلول گرد با شکل یکنواخت با قطر ۵-۸ میکرومتر مشاهده می‌شوند.

سخن پایانی

تکنیک رنگ آمیزی کالکوفلور سفید  یک روش رایج برای رنگ آمیزی عناصر قارچی در نمونه و تشخیص آن‌ها است. این روش محدودیت هایی دارد. به عنوان مثال روش گرانی است. زیرا آزمایشگاه‌های معمولی نمی‌توانند میکروسکوپ فلورسانس با فیلتر طول موج ۳۹۰-۴۲۰ نانومتر را خریداری کنند. با این وجود سرعت و حساسیت خوب این تکنیک، سبب شده تا کاربرد گسترده‌ای در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی و قارچ شناسی داشته باشد.

در این مقاله سعی کردیم به بررسی این تکنیک رنگ امیزی و اصول و نتایج آن بپردازیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.

شما در آزمایشگاه خود برای رنگ آمیزی قارچ از چه تکنیکی استفاده می کنید؟