رنگ‌آمیزی

رنگ آمیزی گیمسا

رنگ گیمسا (متیلن بلو، آزور و ائوزین) یکی از محبوب‌ترین و رایج‌ترین رنگ‌های میکروسکوپی در دنیا است که در هماتولوژی (خون‌شناسی)، هیستولوژی (بافت شناسی)، سیتولوژی، باکتریولوژی و همچنین برای تعیین جواب آزمایش در آزمایشگاه‌ها (IVD) مورد استفاده قرار می‌گیرد.

رنگ گیمسا به دلیل فرمول منحصر به فردی که دارد، به عنوان یک رنگ همه کاره در آزمایش‌ها شناخته شده است. در ادامه این مطلب قصد داریم شما را با رنگ گیمسا بیش‌تر آشنا کنیم، طرز تهیه محلول گیمسا را آموزش دهیم و پروتکل‌های رنگ‌آمیزی گیمسا با توجه به نوع نمونه و کاربرد مورد نظر را شرح دهیم.

کاربرد رنگ گیمسا 

رنگ گیمسا برای بررسی موارد زیر مورد استفاده قرار می‌گیرد:

  • سلول‌های خون
  • مغز استخوان
  • خلط
  • ادرار و ترشحات بدن
  • لاواژ
  • FNAB (بیوپسی از طریق آسپیراسیون با سوزن ظریف)
  • Imprints
  • برش‌های بافت پارافینی (به عنوان مثال نمونه‌ برداشته شده از معده برای تشخیص هلیکوباکتر پیلوری)
  • گره‌های لنفاوی
  • نمونه‌های برداشته شده از طحال
  • لوزه‌ها

رنگ گیمسا جهت تعیین تمایزهای موجود در سلول‌های خون

به طور کلی برای مطالعه سلول‌های خونی لازم است آن‌ها را رنگ‌آمیزی کنید. با این کار سلول‌ها به راحتی زیر میکروسکوپ قابل مشاهده هستند و می‌توانید آن‌ها را مورد بررسی قرار دهید.

رنگ‌ گیمسا ترکیبی از رنگ اصلی متیلن بلو (رنگینه متیلن آبی) و اسید ائوزین (رنگینه ائوزین) هستند که حین رنگ‌آمیزی طیف وسیعی از رنگ‌ها را ایجاد می‌کنند.

رنگ متیلن بلو خاصیت بازی دارد و قسمت‌های اسیدی سلول را رنگ می‌کند و رنگ ائوزین خاصیت اسیدی دارد و ساختارهای بازی سلول را رنگ می‌کند. هسته سلول به خاطر وجود نوکلئیک اسیدها خاصیت اسیدی دارد و وقتی با متیلن بلو رنگ‌آمیزی شود به رنگ آبی مشاهده می‌شود. همچنین دانه‌های موجود در سیتوپلاسم سلول خاصیت بازی دارند و با ائوزین به رنگ نارنجی مشاهده می‌شوند.

pH محلول‌های رنگ‌آمیزی از اهمیت بالایی برخوردارند و باید با فیکساتیوهای مختلفی که مورد استفاده قرار می‌گیرند، هماهنگ شوند. هرچه pH یک محلول رنگ‌آمیزی کم‌تر (محلول اسیدی‌تر) باشد کروماتین‌های بیش‌تری رنگ‌آمیزی می‌شوند و بازوفیل‌های سیتوپلاسم کم‌تر رنگ‌آمیزی می‌شوند. در مقابل، هرچه pH یک محلول رنگ‌آمیزی بیش‌تر (محلول بازی‌تر) باشد، هسته‌های متراکم سلول کم‌تر رنگ‌آمیزی شده و  بازوفیل‌های سیتوپلاسمی بیش‌تر رنگ‌آمیزی می‌شوند.

دامنه pH محلول‌های رنگ‌آمیزی می‌تواند در محدوده ۴/۶ تا ۹/۶ متغیر باشد.

در ادامه به عنوان نمونه رنگ‌آمیزی یک بافت را مورد بررسی قرار می‌دهیم:

  • بافت مورد بررسی: طحال
  • فیکساتیو (ثابت کننده): فرمالین %۱۰، فیکساتیو B-5
  • تکنیک: قطعات پارافین حاوی بافت نمونه را ۴-۵ میکرون برش دهید.
  • تجهیزات مورد نیاز: ظروف شیشه‌ای آزمایشگاهی که با آب دیونیزه (DI) شسته شده‌اند، کاغذ فیلتر، جار [۱] و ست رنگ‌آمیزی، پیپت.
ست رنگ‌آمیزی پل ایده‌آل پارس
  • تجهیزات حفاظت فردی (PPE): از دستکش، عینک و روپوش‌های آزمایشگاهی استفاده کنید.

توجه: از استنشاق رنگ‌ها و مواد شیمیایی موجود در آزمایشگاه و لمس آن‌ها با دست اکیداً خودداری فرمایید.

واکنش‌دهنده‌های مورد نیاز

  • رنگ رایت استوک (WRIGHT STAIN) (آماده)
  • رنگ گیمسا استوک (GIEMSA STAIN)

(می‌توانید رنگ گیمسا را به صورت آماده از بازار تهیه کنید یا با ترکیب (۸/۳g) پودر گیمسا + (۲۵۰ml)  گلیسرول + (۲۵۰ml) متانول خالص، خودتان آن را بسازید. برای مطالعه جزئیات به بخش نحوه تهیه رنگ گیمسا که در ادامه بیان شده است مراجعه نمایید.)

  • بافر فسفات با ۸/۶pH=: دی سدیم فسفات (۳/۰گرم) + مونو سدیم فسفات (۷/۰ گرم) + آب مقطر (۱۰۰ میلی‌لیتر) – می‌توانید این محلول را به مدت ۱ سال در یخچال نگهداری کنید و از آن استفاده کنید.
  • محلول رنگ گیمسا: بافر فسفات (۵۰ میلی‌لیتر) + رنگ گیمسا (۵/۲ میلی‌لیتر) + متانول بدون استون (۵/۲ میلی‌لیتر) – لازم است این محلول به صورت تازه تهیه شود، با فیلتر صاف شود و بعد از استفاده دور ریخته شود.
  • آب استیک (ACETIC WATER): اسید استیک (۱/۰ میلی‌لیتر) + آب مقطر (۴۰۰ میلی‌لیتر) – می‌توانید به مدت ۱ سال از این محلول استفاده کنید.

نحوه تهیه رنگ گیمسا استوک

الف) مواد و وسایل مورد نیاز:

  • ۸/۳ گرم پودر گیمسا
  • ۲۵۰ میلی‌لیتر متانول خالص (بدون استون)
  • ۲۵۰ میلی‌لیتر گلیسرول
  • اسپاتول آزمایشگاهی برای برداشتن مواد
  • کاغذ توزین
  • ۵۰ عدد مهره‌ی شیشه‌ای با قطر ۳-۵ میلی‌متری که با متانول تمیز شده‌اند
  • استوانه مدرج (مزور)
  • قیف شیشه‌ای یا پلاستیکی
  • ظرف شیشه‌ای درب دار تیره یا کهربایی با ظرفیت ۵۰۰ میلی‌لیتر
  • ترازوی آنالیتیکال برای اندازه‌گیری دقیق
  • شیکر برای هم زدن مواد
گلاسبید

ب) روش تهیه رنگ گیمسا استوک در آزمایشگاه:

۱- ابتدا ۵۰ مهره شیشه‌ای یا گلاسبید [۲] (گلوله‌های شیشه‌ای در سایزهای ۲-۶ میلی‌متری که برای اختلاط بهتر مواد و توزیع یکنواخت گرما) را درون یک بطری شیشه‌ای تیره بریزید.

۲- پودر گیمسا را روی کاغذ توزین بریزید و آن را روی ترازو وزن کنید تا بتوانید ۸/۳ گرم از پودر را بردارید. سپس آن را به وسیله قیف در بطری شیشه‌ای بریزید.

۳- به آرامی حدود ۱۰۰ میلی‌لیتر از متانول خالص را به وسیله قیف داخل بطری شیشه‌ای بریزید و مطمئن شوید که تمام پودر گیمسا درون ظرف ریخته شده باشد.

۴- درب ظرف را ببندید و آن را با حرکت دورانی به مدت ۲-۳ دقیقه تکان دهید تا بلورهای رنگ در متانول حل شود.

۵- ۲۵۰ میلی‌لیتر گلیسرول را با قیف به مخلوط اضافه کنید و مجددا به مدت ۳-۵ دقیقه تکان دهید تا محتویات آن به خوبی حل شوند.

۶- ۱۵۰ میلی‌لیتر باقی مانده از متانول را از طریق قیف به ظرف اضافه کنید و مطمئن شوید که متانول، آخرین قطره‌های گلیسرول موجود روی قیف را پاک کرده است و آن را درون بطری شیشه‌ای ریخته است.

۷- درب بطری شیشه‌ای را محکم کنید و شش بار در روز حدودا ۲-۳ دقیقه آن را تکان دهید.

۸- حداقل به مدت ۷ روز و هر روز شش مرتبه حدود ۲-۳ دقیقه آن را تکان دهید. برای این منظور بهتر است از شیکرهای آزمایشگاهی استفاده کنید. در صورت عدم وجود شیکر در آزمایشگاه، محلول را به صورت دستی تکان دهید.

۹- بطری را با نام محلول استوک گیمسا (Giemsa Stock Solution) به شکل واضح لیبل‌گذاری کنید و تاریخ آماده سازی محلول، تاریخ انقضای محلول و نام شخص تهیه کننده آن را روی لیبل درج کنید.

۱۰-  درب بطری را محکم کنید تا از جذب بخار آب به درون بطری جلوگیری شود. لازم است این محلول در جای خشک و خنک و دور از تابش مستقیم خورشید نگهداری شود.

روش انجام رنگ‌آمیزی رایت-گیمسا

  1. به وسیله الکل خالص پارافین زدایی را انجام دهید.
  2. سه مرتبه لام را در متانول قرار دهید و سپس از آن خارج کنید.
  3. لام را روی ست رنگ‌آمیزی قرار دهید و آن را با رنگ رایت بپوشانید اجازه دهید رنگ به مدت ۵ دقیقه روی لام باقی بماند.
  4. رنگ را از روی لام پاک نکنید. به همان اندازه آب مقطر به آن اضافه کنید تا جلای فلزی بگیرد. سپس لام را به مدت ۵ دقیقه در همین حالت نگهدارید.
  5. در مرحله بعد لام را مستقیما درون محلول گیمسا بگذارید و به مدت ۴۵ دقیقه آن را در دمای اتاق قرار دهید.
  6. مرحله بعدی افتراق و دهیدراسیون است. به جدول زیر توجه کنید:

مواد مورد نیاز

پروسه

۱- آب استیک (acetic water) ۳ مرتبه لام را درون آب استیک قرار دهید.
۲- آب مقطر (distilled water) ۲ مرتبه لام را درون آب مقطر قرار دهید.
۳- الکل % ۹۵ ۳ مرتبه لام را درون الکل %۹۵ قرار دهید.
۴- الکل %۱۰۰ (خالص) ۳ مرتبه لام را درون الکل خالص قرار دهید.
۵- زایلن ۳ مرتبه لام را درون زایلن قرار دهید.

7- لامل را روی لام قرار دهید.

نتیجه مشاهدات نمونه مورد بررسی زیر میکروسکوپ

نام سلول / باکتری رنگ مشاهده شده
هسته آبی
سیتوپلاسم آبی کم‌رنگ
ریکتزیا Rickettsias (باکتری عامل بیماری تیفوس) بنفش مایل به قرمز
اریتروسیت‌ها (گلبول‌های قرمز) صورتی مایل به زرد

دو مورد از مشاهدات به دست آمده از نمونه‌های خون رنگ‌آمیزی شده با رنگ (رایت-گیمسا):

نمونه خون رنگ‌آمیزی شده با رنگ رایت-گیمسا
نمونه خون رنگ‌آمیزی شده با رنگ رایت-گیمسا

شکل ۲ نمونه خون رنگ‌آمیزی شده با رنگ رایت-گیمسا.

سلول‌های بنیادی در حال گردش که اندازه آن‌ها از متوسط تا بزرگ است و دارای کروماتین پراکنده و یک یا چند هسته‌ می‌باشند.

سیتوپلاسم نسبتا زیاد است و تعداد بازوفیل‌های آن متغیر است. (دارای درجه بازوفیلی متغیر)

ء

شکل ۱ نمونه خون که با رنگ رایت-گیمسا رنگ‌آمیزی شده است.

این نمونه بازوفیلیک استیپلینگ خشن اریتروسیت‌ها

(Coarse basophilic stippling) را نشان می‌دهد که به دلیل اختلال در فرآیند آنزیم

۵-نوکلئوتیداز (مسئول تجزیه RNA ریبوزومی سلول) ایجاد شده است.

بزرگنمایی تصویر ۱۰۰۰ برابر است.

طرز تهیه محلول گیمسا برای کاربردهای مختلف

محلول‌های گیمسا برای کاربردهای متفاوت، به روش‌های مختلفی تهیه می‌شوند. در هر آزمایشگاه با توجه به مواد مورد استفاده، شرایط رنگ‌آمیزی و دستورالعمل‌های مربوط به آن آزمایشگاه، روش تهیه محلول گیمسا متفاوت است. در جدول زیر برخی از روش‌های متداول تهیه محلول گیمسا ارائه شده‌است. می‌توانید مطابق با نیازمندی‌ها و امکانات آزمایشگاه خود، روش مناسب را انتخاب نمایید.

نام محلول روش تهیه
تهیه محلول گیمسا برای رنگ‌آمیزی فاست در سیتولوژی بالینی [۳] از محلول گیمسا غلیظ استفاده کنید. لام‌ها را به مدت ۱ دقیقه با گیمسای غلیظ رنگ‌آمیزی کنید. سپس لازم است آن را دو مرتبه و هر بار به مدت ۱ دقیقه با محلول بافر با ۶/۸=pH بشویید.
محلول گیمسا برای تشخیص هلیکوباکتر پیلوری[۴] از محلول غلیظ گیمسا استفاده کنید و لام‌ها را با آن رنگ‌آمیزی کنید و بگذارید ۱۵ دقیقه رنگ روی لام بماند سپس لام‌ها را به مدت ۱۰ ثانیه با هر یک از محلول‌های زیر بشویید:

– اسید استیک (%ء۰/۱)

– آب مقطر

– ۲-پروپانول (۳ مرتبه)

تهیه محلول گیمسا برای رنگ‌آمیزی خودکار به وسیله دستگاه [۵] به آرامی (mlء۲۵) محلول گیمسا را به (mlء۲۷۵) محلول بافر اضافه کنید. محلول‌ها را به خوبی با هم مخلوط کنید و اجازه دهید ۱۰ دقیقه به حال خود باقی بماند. (در صورت نیاز محلول را فیلتر کنید.)
تهیه محلول گیمسا با استفاده از

dry dyeء[۶]

می‌توان محلول استوک گیمسا را از روش دیگری نیز تهیه کرد:

(gء۰/۷۶) رنگ گیمسای آزور ائوزین متیلن بلو

(dry dye) را در (mgء۵۰) گلیسرول (%۸۵) بریزید و به مدت ۱ ساعت آن را در دمای ۵۵ درجه سانتی‌گراد در حمام آب قرار دهید. حالا (mlء۵۰) متانول را به آن اضافه کنید و ۲۴ ساعت به محلول استراحت دهید و در صورت لزوم محلول را فیلتر کنید.

واژه نامه

Giemsa’s solution for clinical cytology fast staining [۳] glass beads [۲] Coplin jars [۱]
Giemsa’s solution from Giemsa’s azure eosin methylene blue (dry dye) [۶] Giemsa’s solution for staining with staining automat [۵] Giemsa’s solution for detection of Helicobacter pylori [۴]

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا