محیط کشت NNN برای تشخیص انگل لیشمانیا

لیشمانیوز به گروهی از بیماری‌ها اطلاق می‌شود که توسط انگل‌های تک یاخته‌ای لیشمانیا ایجاد می‌شوند. این انگل‌ها از طریق نیش پشه خاکی ماده ^[۱] آلوده، به انسان منتقل می‌شوند و می‌توانند عوارض ناخوشایندی (مانند ضایعات پوستی، عفونت و …) را برای افراد به همراه داشته باشند.

جهت تشخیص لیشمانیوز در ازمایشگاه‌ها از محیط کشت‌های مختلفی استفاده می‌شوداین محیط کشت‌ها را می توان به سه دسته اصلی تقسیم کرد که عبارتند از:

نیمه جامد، دو فازی و مایع

محیط کشت  Novy-MacNeal-Nicolle که با نام  اختصاری NNN  نیز شناخته می‌شود، یک محیط دو فازی رایج و شناخته شده در جهان برای جداسازی عامل لیشمانیا در نمونه‌ی بیمار است. در ادامه‌ی این مطلب قصد داریم به معرفی محیط کشت NNN، ترکیبات و نتایج حاصل از آن برای تشخیص لیشمانیوز بپردازیم. پس درادامه با ما همراه باشید.

مروری اجمالی بر بیماری لیشمانیوز

ليشمانيوز به گروهی از بیماری‌ها اطلاق می‌شود که توسط انگل لیشمانیا ایجاد می‌گردند.

لیشمانیا یک یوکاریوت تک یاخته است و در طول زندگی، بین دو ساختار مختلف زیر تغییر شکل می‌دهد:

• پروماستیگوت: پروماستیگوت‌ها ساختاری کشیده دارند، متحرک هستند (تاژک بلند) و در مجرای گوارشی پشه خاکی زندگی می‌کنند.
• آماستیگوت: آماستیگوت‌ها ساختاری گرد و بسیار کوچک‌تر از پروماستیگوت‌ها دارند، غیر متحرک هستند و درون سلول‌های میزبان زندگی می‌کنند.

ليشمانيوز به اشكال پوستي (سالك)، مخاطي – پوستي (اسپونديا) و احشائي (كالاآزار) مشاهده مي‌شود. ليشمانيوز احشائي با مرگ وميربالا همراه است. اما در بيماري سالك معمولاً مرگ و مير زیادی مشاهده نمي‌شود.

با این وجود سالک باعث ايجاد ضايعات بد شكل پوستي شده كه در برخي موارد تا بيش ازيكسال باقي مي‌مانند و معمولا اسکار ناشی از آن حتي با استفاده از درمان نیز تا آخرعمر بر روي بدن باقي مي‌ماند.

از طرف ديگر عفونت هاي باكتريایي و قارچي ثانويه شامل عفونت‌هاي نسوج سطحي وعمقي، آبسه، سپتي سمي و حتي كزاز از عواض زخم سالك مي‌باشند كه ممكن است گاهي موجب ناتواني وحتي مرگ بيمار گردد.

به همین دلیل، تشخیص به موقع بیماری لیشمانیوز جهت جلوگیری شدت یافتن عوارض ناشی از آن اهمیت زیادی دارد.

محیط کشت NNN برای تشخیص انگل لیشمانیا

محیط کشت NNN از دو فاز تشکیل شده است:

• فاز اول-آگار خون (جامد): یک محیط بسیار مغذی = که ارگانیسم‌های فستی‌دیوس (fastidious) مانند لیشمانیا و تریپانوزوما به خوبی در آن رشد می‌کنند.
• فاز دوم: محلول (مایع): نمونه‌ها در فاز مایع محیط کشت تلقیح شده و انکوبه می‌شوند.

کاربردهای محیط کشت  NNN

محیط کشت NNN یک محیط کشت رایج برای شناسایی و تشخیص گونه‌های لیشمانیا در نمونه‌ی افراد مشکوک است. اما این محیط کشت کاربردهای دیگری نیز در آزمایشگاه دارد که در ادامه به بررسی آن‌ها خواهیم پرداخت.

۱. تایید تشخیص بیماری:

همانطور که در قسمت مقدمه نیز گفته شد، روش‌ها و محیط کشت‌های مختلفی برای بررسی انگل لیشمانیا وجود دارد.  اما می‌توان گفت که در اغلب موارد محققین ترجیح می‌دهند از تکنیک رنگ‌آمیزی گیمسا و یا از آزمایش‌های سرولوژیکی مانند rK39، DAT برای تشخیص انگل لیشمانیا (به ویژه در لیشمانیوز احشایی) استفاده کنند. در واقع محیط کشت NNN، در موارد مبهم و نامعین، می‌تواند تشخیص را تایید کند.

۲. استفاده در مطالعات سرولوژیکی:

کشت آزمایشگاهی لیشمانیا پروماستیگوت در محیط کشت NNN برای به دست آوردن تعداد زیادی ارگانیسم جهت استفاده در مطالعات سرولوژیکی ضروری است.

۳. کاربردهای تحقیقاتی:

محیط کشت NNN جهت بررسی ساختار آنتی ژنی، خواص بیوشیمیایی و قابلیت‌های عفونی گونه لیشمانیا نیز کاربرد زیادی دارد.

ترکیبات محیط کشت NNN

مواد تشکیل دهنده این محیط کشت در ادامه ذکر شده است:

فاز اول (میزان مواد بر حسب گرم بر لیتر)

• عصاره گوشت …………..۳٫۰۰۰
• پپتیک دایجست بافت حیوانی……… ۵٫۰۰۰
• کلرید سدیم ………… ۸٫۰۰۰
• آگار ……………… ۱۵٫۰۰۰

pH نهایی (در ۲۵ درجه سانتی‌گراد): ۰٫۲ ± ۷٫۳

فاز دوم (میزان مواد بر حسب گرم بر لیتر)

• کلرید سدیم ………… ۸٫۰۰۰
• کلرید پتاسیم ………… ۰٫۲۰۰
• کلرید کلسیم …………۰٫۲۰۰
• مونوپتاسیم دی هیدروژن فسفات ………… ۰٫۳۰۰
• دکستروز …………۲٫۵۰۰

pH نهایی (در ۲۵ درجه سانتی‌گراد) ۰٫۲± ۷٫۰

نحوه آماده‌سازی محیط کشت

محیط کشت NNN را می‌توان در آزمایشگاه آماده نمود اما در اغلب موارد به دلیل سختی آماده‌سازی، محققین ترجیح می‌دهند پودر این محصول را به صورت تجاری خریداری کرده و آن‌را به صورت محیط کشت آماده کنند.

تامین کنندگان تجاری بیشتر محیط‌های دهیدراته شده را به شکل پودر عرضه می‌کنند. اما جهت استفاده لازم است این پودر به صورت محیط کشت به روش زیر آماده گردد:

فاز اول:

• ۳۱ گرم از پودر محیط کشت NNN را در ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل کنید.
• محلول را حرارت دهید تا پودر کاملا در آب حل شود.
• محلول را در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو کنید.
• سپس اجازه دهید تا محلول خنک شود و به دمای ۴۵ درجه سانتیگراد برسد.
• خون خرگوش بدون فیبرین استریل را به صورت آسپتیک به محلول اضافه کنید. ) می‌توان از خون گوسفندی یا انسان نیز استفاده کرد)
• پس از اینکه محلول کاملا یکنواخت شد، ۵ میلی لیتر از آن را در لوله‌ای آزمایش بریزید.
• اگر از فلاسک استفاده می‌کنید، ۲۵ میلی لیتری از محلول را در آن بریزید.
• لوله را به صورت مایل قرار داده و اجازه دهید محیط کشتِ درون آن خنک شود.

فاز دوم:

• ۱۱/۲ گرم از فاز دوم محیط کشتNNN را در ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل کنید.
• محلول را حرارت دهید تا پودر کاملا در آب حل شود.
• محلول را در دمای ۱۲۱ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو کنید.
• اجازه دهید محلول خنک شود. سپس حدود ۲ میلی لیتر از آن را در لوله (یا ۱۰ الی۱۵ میلی لیتر از آن را در فلاسک‌ها) روی محیط جامد شده فاز اول اضافه کنید.

اگر محیط آماده شده را تا زمان استفاده در یخچال نگهداری کنید، به مدت ۲ الی ۴ هفته پایدار است. محیط کشت را درست قبل از استفاده، به دمای اتاق برسانید.

نتایج حاصل از کشت لیشمانیا روی محیط کشت NNN

جهت بررسی وجود لیشمانیا در نمونه، لازم است نمونه‌ی گرفته شده از بیمار (آسپیره طحال یا بیوپسی مغز استخوان یا آسپیره غدد لنفاوی) در فاز مایع محیط دوفازی تلقیح شود.

سپس محیط کشت در دمای ۲۱ الی ۲۶ درجه سانتی‌گراد به مدت ۴ هفته انکوباسیون خواهد شد.

جهت بررسی رشد ارگانیسم و آلودگی احتمالی پس از ۴ روز محیط کشت را بررسی کنید. این کار را  به فواصل ۴ روزه برای ۴ هفته ادامه دهید.

اگر وجود ارگانیسم مثبت باشد، رشد شدید ارگانیسم در محیط کشت دیده خواهد شد.

ارگانیسم رشد کرده روی محیط کشت را به روش Giemsa رنگ آمیزی کرده و آن را زیر میکروسکوپ بررسی کنید. لیشمانیا پروماستیگوت قابل مشاهده است.

توجه داشته باشید که گونـه‌هـاي مختلـف ليـشمانيا در درجـه حـرارت يكـسان و در محـيط كـشت NNN رشد متفاوتي دارند. برخی از آن‌هاداراي سـرعت رشـــد بيـــشتری هستند و تعـــداد پروماســـتيگوت زيـــادتري را نـــشان مي‌دهند. اين خصوصيات در شناسايي گونه وزيرگونه‌هـاي ليشمانيا بسيار اهميـت دارد.

همچنین رشد انگل در محيط‌هاي كشت حاوی خـون خرگـوش، گـاو، گوسفند، بز و گروه‌هاي خوني مختلف انسان نیز ممکن است متفاوت باشد.

جمع‌بندی

همانطور که در این مطلب گفته شد، محیط کشت NNN یک محیط دو فازی برای بررسی انگل لیشمانیا و تشخیص انواع لیشمانیوز است. با توجه بـه شـيوع ليمشانيوز، اهميت شناخت، تشخيص به موقع و مبارزه با آن بسیار اهمیت دارد و در مواردی ممکن است تشخيص لام مستقيم ( نمونه‌ی رنگ آمیزی شده روی لام بدون کشت نمونه) به سـختي انجام شود. در چنین شرایطی كشت نمونه در تشخيص گونه‌هاي مختلف انگـل مفيد خواهد بود. محیط کشت NNN  می‌تواند در موارد مبهم و نامعین، در کنار رنگ امیزی گیمسا مورد استفاده قرار گرفته و تشخیص را تایید کند.

در این مطلب سعی کردیم ضمن مروری اجمالی بر لیشمانیوز، محیط کشت NNN را نیز بررسی کنیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.

واژه نامه: