انگل در مواد غذایی؛ روشهای شناسایی و بررسی آلودگی انگلی در غذاها
مقدمه؛ انگل در مواد غذایی چگونه وارد بدن انسان میشود؟
انسان ممکن است بدون آگاهی، همراه با مواد غذایی برخی جانوران میکروسکوپی یا ماکروسکوپی کوچک را وارد بدن خود کند. اگرچه بسیاری از این موجودات در فرایند گوارش از بین میروند یا بدون استقرار در بدن دفع میشوند، برخی انگلها میتوانند در بدن انسان مستقر شده و به حیات خود ادامه دهند. ازاینرو، وجود انگل در مواد غذایی یکی از موضوعات مهم در بررسی ایمنی و سلامت مواد غذایی به شمار میرود.
برخی انگلها بدون ایجاد علامت باقی میمانند، درحالیکه برخی دیگر میتوانند موجب بیماری و حتی عوارض شدید یا پایدار شوند. بنابراین، شناسایی عوامل انگلی و بررسی آلودگی انگلی مواد غذایی نقش مهمی در ارزیابی خطر و کنترل ایمنی مواد غذایی دارد. با توجه به تفاوت نوع و بافت مواد غذایی، روشهای مختلفی برای شناسایی و جداسازی انگلها به کار گرفته میشود که در بسیاری از موارد زمانبر و نیازمند نیروی انسانی هستند.
در این مقاله، ابتدا روشهای بررسی انگل در محصولات آبزی مانند ماهی و صدف مرور میشود و سپس یکی از روشهای آزمایشگاهی جداسازی انگل از بافت خوراکی، یعنی روش هضم، مورد بررسی قرار میگیرد.
روشهای بررسی انگل در ماهی و صدف
بر اساس این دستورالعمل FDA، روش نوربینی (Candling) تنها روشی است که در حال حاضر برای اهداف نظارتی مربوط به ماهیان بالهدار مورد استفاده قرار میگیرد. انتخاب روش مناسب برای بررسی این محصولات به نوع آبزی و هدف آزمایش بستگی دارد و میتواند در شناسایی آلودگی انگلی مواد غذایی نقش مهمی داشته باشد.
پس از بررسی روشهای مورد استفاده برای ماهی و صدف، در ادامه به یکی از روشهای مهم برای جداسازی انگلها از بافت خوراکی میپردازیم. این روش با شبیهسازی شرایط معده پستانداران، امکان آزادسازی انگلها از بافت اطراف و بررسی دقیقتر آنها را فراهم میکند.
هضم بافت خوراکی برای جداسازی انگلهای مرتبط با پستانداران از بافت خوراکی
روش هضم (Digestion) با هدف جداسازی انگلها از بافت خوراکی طراحی شده است. در این روش، با شبیهسازی شرایط شیمیایی و دمایی معده پستانداران، انگلها از بافت اطراف خود آزاد میشوند و در عین حال، میزان حضور موجودات غیرانگلی در نمونه کاهش مییابد. در نتیجه، شرایط برای جداسازی و شناسایی دقیقتر انگل در مواد غذایی فراهم میشود.
در ادامه به بررسی تجهیزات مورد نیاز و روش انجام این فرایند خواهیم پرداخت.
الف) تجهیزات و مواد موردنیاز
برای اجرای روش هضم و بررسی آلودگی انگلی مواد غذایی، تجهیزات و مواد زیر مورد نیاز است:
- ترازو با ظرفیت حداقل ۲۵۰ گرم
- همزن یا شیکر انکوباتور چرخشی
- حمام آب با دمای ۳۷ ± ۰٫۵ درجه سانتیگراد
- بشر با حجمهای ۱۰۰ و ۱۵۰۰ میلیلیتر
- قیف تهنشینی و پایه نگهدارنده با ظرفیت یک لیتر، پلاستیکی و دارای درپوش قابل جدا شدن؛ مانند قیف ایمهوف (Imhoff cone)
- لوله کهرباییرنگ با قطرهای ۲٫۴ و ۹٫۵ میلیمتر
- گیره لوله
- میکروسکوپ تشریحی و میکروسکوپ معکوس
- ظروف کشت پلاستیکی یا پلیتهای پتری در اندازههای مختلف
- الک شماره ۱۸ مطابق سری الک استاندارد ایالات متحده، با اندازه چشمه ۱ میلیمتر، قطر ۲۰۴ میلیمتر و ارتفاع ۵۱ میلیمتر؛ استفاده از اندازههای دیگر الک نیز اختیاری است.
- سینی مستطیلی پلیپروپیلنی با ابعاد تقریبی ۳۲۵ × ۲۶۰ × ۷۵ میلیمتر
- استوانه مدرج با ظرفیت یک لیتر
- pH متر
- پیپت پاستور یا قطرهچکانهای پلیپروپیلنی
- پوآر لاستیکی با ظرفیت تقریبی ۲ میلیلیتر
- قاشق
- اسپاتول
- مواد و تجهیزات اختیاری: بلندر، چرخ گوشت، غذاساز، هود با فشار منفی، فویل، سلفون، پنس و سوزنهای تشریح
ب) معرفهای موردنیاز برای بررسی انگل در مواد غذایی
- محلول سالین فیزیولوژیک (R63)
- پپسین با گرید آزمایشگاهی
- محلولهای مرجع pH
- اسید هیدروکلریک (HCl) غلیظ
- معرفهای اختیاری: پاپائین، اتانول، اسید استیک گلاسیال، گلیسیرین، لاکتوفنول، فنول، فرمالین، ید لوگول (R40) و اتر
ج/ نمونهبرداری و آمادهسازی نمونه برای بررسی انگل در مواد غذایی
از یک نمونه یککیلوگرمی، یک زیرنمونه شامل ۱۰۰ گرم گوشت گاو، گوشت خوک یا گوشت طیور یا ۲۵۰ گرم ماهی بردارید. زیرنمونه بیشتر گوشتهای پستانداران، طیور و ماهی معمولاً به آمادهسازی بیشتری نیاز ندارد. بااینحال، برای افزایش سطح تماس نمونه، میتوان آن را به پنج قطعه یا بیشتر تقسیم یا از هم جدا کرد.
نمونههایی که مقدار نسبتاً زیادی بافت همبند دارند، بهراحتی هضم نمیشوند؛ برای مثال، هضم گوشت حلزون بهخوبی انجام نمیشود. برای بهبود فرایند هضم و افزایش احتمال شناسایی انگل در مواد غذایی میتوان از روشهای آمادهسازی زیر استفاده کرد.
در یکی از روشها، ۱۰۰ گرم نمونه در ۷۵۰ میلیلیتر محلول سالین مخلوط میشود. استفاده از بلندر و ایجاد ۱۰ پالس کوتاه و لحظهای میتواند برخی موجودات ماکروسکوپی را از بین ببرد، اما معمولاً تأثیری بر موجودات میکروسکوپی ندارد.
استفاده از چرخ گوشت تخریب کمتری ایجاد میکند، اگرچه برای برخی مواد غذایی مانند گوشت حلزون مناسب نیست. کمتخریبترین روش، هضم اولیه نمونه با پاپائین (papain) و سپس انجام هضم با پپسین (pepsin) است. انتخاب روش مناسب آمادهسازی میتواند در بررسی دقیقتر آلودگی انگلی مواد غذایی مؤثر باشد.
هشدار ایمنی هنگام آمادهسازی نمونه
برخی عوامل بیماریزا که بهراحتی در محیط منتشر میشوند ممکن است در نمونهها وجود داشته باشند و در اثر فرایند هضم آزاد شوند. کیستهای ماکروسکوپی کرمهای نواری و کیستهای میکروسکوپی تکیاختهها از جمله مواردی هستند که باید مورد توجه ویژه قرار گیرند.
در صورت مشکوک بودن نمونه به وجود چنین عوامل بیماریزایی، فرایند هضم و مراحل بعدی آمادهسازی نمونه باید در هود با فشار منفی انجام شود تا زمانی که نمونه هضمشده مشکوک در یک ظرف کاملاً بسته و ایمن قرار گیرد.
تمام وسایل مورد استفاده باید بهعنوان وسایل آلوده در نظر گرفته شوند و پس از پایان کار، با اتوکلاو استریل یا سوزانده شوند. رعایت این نکات در زمان بررسی انگل در مواد غذایی برای جلوگیری از انتشار عوامل بیماریزا ضروری است.
د/ هضم، تهنشینی و بررسی نمونه
برای شروع فرایند، شیکر انکوباتور یا حمام آب را روی دمای۳۷ ± ۰٫۵ درجه سانتیگراد تنظیم کنید.
مایع هضم را در یک بشر ۱۵۰۰ میلیلیتری آماده کنید. برای این کار، ۱۵ گرم پپسین را در ۷۵۰ میلیلیتر محلول سالین حل کرده، سپس نمونه را اضافه کنید. با استفاده از اسید هیدروکلریک غلیظ، pH را به ۲ برسانید؛ برای این کار تقریباً ۳ میلیلیتر HClمورد نیاز است.
نمونه را در انکوباتور یا حمام آب قرار دهید و پس از رسیدن نمونه به دمای موردنظر، آن را با سرعت تقریبی ۱۰۰ دور در دقیقه هم بزنید. پس از حدود ۱۵ دقیقهpH را دوباره بررسی کرده و در صورت نیاز تنظیم کنید.
بشر را با فویل آلومینیومی بپوشانید. اگر از همزن استفاده میشود، سوراخ کوچکی برای عبور میله همزن ایجاد کنید. سپس انکوباسیون را تا کامل شدن فرایند هضم ادامه دهید. مدت زمان موردنیاز برای هضم به نوع نمونه بستگی دارد، اما نباید از ۲۴ ساعت بیشتر شود.
پس از پایان هضم، محتویات بشر را با دقت از یک الک عبور داده و درون سینی جمعآوری کنید. با استفاده از ۲۵۰ میلیلیتر محلول سالین، باقیمانده نمونه را شستوشو دهید و محلول حاصل را نیز به نمونه هضمشده اضافه کنید.
محتویات شستهشده روی الک را بررسی کرده و نتایج را ثبت کنید. انگلهای بزرگتر معمولاً روی الک باقی میمانند. در این مرحله، بررسی دقیق نمونه میتواند به شناسایی انگل در مواد غذایی و تعیین میزان آلودگی انگلی مواد غذایی کمک کند.
ه/ تهنشینی و بررسی میکروسکوپی
درپوش خروجی قیف تهنشینی را بردارید و یک لوله لاستیکی به خروجی آن متصل کنید. سپس لوله را تا کرده و با گیره محکم ببندید تا از خروج مایع جلوگیری شود. در ادامه، محتویات سینی را با دقت داخل قیف تهنشینی منتقل کنید. نمونه هضمنشده یا انگلهای مشاهدهشده را با استفاده از قاشق، پنس یا سوزن تشریح به یک پتری دیش منتقل کنید.
پس از گذشت یک ساعت از تهنشینی، گیره لوله را باز کنید تا ۵۰ میلیلیتر از بخش پایینی محتویات قیف تهنشینی خارج شود. این بخش را در یک بشر ۱۰۰ میلیلیتری جمعآوری کنید. سپس با استفاده از قطرهچکان، مایع جمعآوریشده را به یک یا چند پلیت منتقل کنید.
شفافیت نمونههای هضمشده میتواند متفاوت باشد. اگر نمونه غلیظ و کدر است، آن را با محلول سالین رقیق کنید تا حالت نیمهشفاف پیدا کند.
ابتدا ظرف را پوشانده و نمونه را از نظر وجود انگل بهصورت ماکروسکوپی بررسی کنید. سپس بررسی را با میکروسکوپ تشریحی و در نهایت با میکروسکوپ معکوس ادامه دهید. استفاده از زمینهای با کنتراست مناسب میتواند به مشاهده بهتر انگلها کمک کند.
تعداد انگلها را شمارش کرده، در صورت امکان بهطور مقدماتی شناسایی کنید و مشاهدات خود را ثبت کنید. همچنین تعداد کل موجودات را مشخص کرده و در صورت امکان، موجودات زنده یا متحرک را از موجودات مرده یا غیرمتحرک تفکیک کنید.
تمام محتویات بشر را بررسی کنید. در مواردی که میزان آلودگی پایین است، ممکن است برای شناسایی انگلها به نمونهبرداری مکرر نیاز باشد.
و/ تفسیر نتایج و شناسایی تکمیلی انگلها
برای طبقهبندی موجودات بازیابیشده و همچنین تعیین اینکه آیا حرکت آنها میتواند معیار مناسبی برای تشخیص زنده بودن باشد یا خیر، معمولاً به اطلاعات تکمیلی نیاز است.
برای مثال، تخمهای آسکاریس (Ascaris) باید جنیندار (Embryonated) شوند؛ یعنی برای مدتی انکوبه شوند تا جنینهای متحرک در داخل تخم شکل بگیرند. در مورد کیست برخی تکیاختهها نیز برای مشاهده حرکت، لازم است فرایند خروج از کیست (Excystation) انجام شود.
در مورد Toxoplasma gondii، زنده بودن انگل تنها از طریق نتیجه تلقیح آزمایشی آن در حفره صفاقی موش قابل ارزیابی است.
در ادامه، روشهای مختصری برای تثبیت و رنگآمیزی انگلهایی که معمولاً از نمونههای غذایی بازیابی میشوند ارائه شده است. اطلاعات تکمیلی درباره شناسایی و آمادهسازی این انگلها را میتوان در منابع تخصصی حوزههای مختلف، از جمله انگلشناسی بیمهرگان، انگلهای جانوری، جنبههای پزشکی انگلشناسی، انگلشناسی مواد غذایی، ایمنیشناسی و سرولوژی بیماریهای انگلی و همچنین منابع اختصاصی مربوط به تکیاختهها، نماتودها، ترماتودها، سستودها و بندپایان، مطالعه کرد.
تثبیت و رنگآمیزی انگلها
روش تثبیت و رنگآمیزی بسته به نوع انگل متفاوت است و انتخاب روش مناسب، نقش مهمی در شناسایی دقیق عوامل آلودگی انگلی مواد غذایی دارد.
کیستهای تکیاختهای و تخم کرمهای انگلی
نمونه تازه را با استفاده از محلول ید لوگول (Lugol’s iodine R40) تثبیت و رنگآمیزی کنید. در صورت دسترسی، میتوان از رنگآمیزی با آنتیبادی فلورسنت برای نمونههای تثبیتشده با فرمالین نیز استفاده کرد.
نماتودها
نماتودها را به مدت یک شب در اسید استیک گلاسیال (Glacial acetic acid) تثبیت کنید و سپس در اتانول ۷۰ درصد حاوی ۱۰ درصد گلیسیرین نگهداری کنید .برای بررسی ریختشناسی (مورفولوژیک) نماتودها در تهیههای موقت، نمونه را از الکل خارج کرده و با استفاده از گلیسیرین، لاکتوفنول یا فنل-اتانول شفاف کنید. پیش از بازگرداندن نمونه به محلول نگهدارنده، مواد شفافکننده را با اتانول ۷۰ درصد بشویید.
برای شناسایی دقیقتر برخی از نماتودها، ممکن است لازم باشد پس از تثبیت، از نمونه برشهای بسیار نازک بافتی تهیه و سپس رنگآمیزی شوند. این کار امکان بررسی ساختارهای داخلی نماتود را در زیر میکروسکوپ فراهم میکند و به شناسایی دقیقتر گونه کمک میکند.
ترماتودها و سستودها
پیش از تثبیت، هر دو گروه کرمهای پهن شامل ترماتود و سستود را به مدت ۱۰ دقیقه در آب مقطر سرد قرار دهید تا شل و آماده تثبیت شوند.
ترماتودها (Flukes)را در فرمالین ۱۰ درصد داغ با دمای ۶۰ درجه سانتیگراد تثبیت کنید.
برای تثبیت کرمهای نواری یا سستودها، حجمی معادل ۱۰ برابر حجم نمونه از محلول تثبیتکننده با دمای ۷۰ درجه سانتیگراد به مایع حاوی نمونه اضافه کنید یا نمونه را چندین بار در آب ۷۰ درجه سانتیگراد فرو ببرید. سپس آنها را یک شب در مخلوط اتانول، اسید استیک گلاسیال و فرمالین با نسبت ۸۵:۱۰:۵ تثبیت کنید.
نمونهها را در اتانول ۷۰ درصدنگهداری کنید. کرمهای پهن معمولاً رنگآمیزی شده و بهصورت اسلاید دائمی تهیه میشوند، اما برای شناسایی دقیق برخی نمونهها ممکن است برشگیری و رنگآمیزی نیز لازم باشد.
آکانتوسفالها
نمونه را در آب قرار دهید تا پروبوسیس (Proboscis) به سمت بیرون برگردد. برخی پروبوسیسها تقریباً بلافاصله بیرون میآیند، در حالی که برخی دیگر به چند ساعت زمان نیاز دارند. این فرایند نباید بیش از ۸ ساعت ادامه پیدا کند.
نمونه را در اتانول ۷۰ درصد داغ که چند قطره اسید استیک گلاسیال به آن اضافه شده است، تثبیت کنید. نمونه را در محلول تثبیتکننده یا اتانول ۷۰ درصد نگهداری کنید.
آکانتوسفالها را میتوان رنگآمیزی کرده و بهصورت اسلاید دائمی تهیه کرد یا مانند نماتودها، با استفاده از فنل یا گلیسرول شفاف کرد.
بندپایان
ککها، شپشها، کنهها، پاروپایان، لارو مگسها و سایر بندپایان انگلی یا ساکن مواد غذایی را در آب داغ تثبیت کنید و سپس در اتانول ۷۰ درصد نگهداری کنید.
تعیین زندهبودن انگلها
مهمترین معیار برای تعیین زنده بودن کرمهای انگلی (Helminths) ، مشاهده حرکت خودبهخودی آنها ست. موجودات را به مدت ۱۰ دقیقه زیر نظر بگیرید تا مشخص شود آیا حرکت خودبهخودی دارند یا خیر.
اگر حرکت خودبهخودی مشاهده نشد، نمونه را با یک سوزن تشریح لمس کنید و بررسی کنید که آیا تحریک مکانیکی موجب حرکت آن میشود یا خیر.
نمونههایی که از محصولات شور به دست آمدهاند، پیش از ارزیابی زنده بودن باید حداقل به مدت ۳ ساعت در حجمی معادل حداقل ۲۰ برابر حجم نمونه از محلول سالین فیزیولوژیک قرار گیرند تا با شرایط جدید به تعادل برسند. فشار اسمزی ممکن است باعث ایجاد حرکات ظاهری در نمونه شود و در نتیجه، تشخیص زنده بودن انگل را با خطا مواجه کند.
تکیاختههایی که قابلیت کشت دارند، باید برای تعیین زنده بودن در شرایط برونتنی (In vitro) کشت داده شوند. اگر کشت امکانپذیر نباشد، روش حذف رنگ (Dye exclusion) روش انتخابی برای تعیین زنده بودن آنهاست.
روش نوربینی برای شناسایی انگل در ماهیان بالهدار
برای شناسایی انگل در مواد غذایی در ماهیان بالهدار، از روشهای زیر استفاده میشود.
- روش نوربینی (Candling) برای ماهیهای تازه یا منجمد با گوشت سفید که به شکل فیله، بخشهای ضخیم و گوشتی فیله (Loins)، استیک، تکههای ماهی یا ماهی چرخشده فرآوری شدهاند، قابل استفاده است.
- روش بررسی با نور فرابنفش (UV) نیز برای ماهیهایی با گوشت تیره و همچنین برای بررسی پوشش سوخاری جداشده از قطعات ماهی به کار میرود .این روش برای ماهی خشکشده یا ماهی کامل (ماهی دستنخورده و فرآورینشده) کاربرد ندارد.
تجهیزات و مواد مورد نیاز
۱. چاقوی تیز
۲. میز نوربینی (Candling Table): میزی با چارچوبی مستحکم که منبع نور را در زیر یک سطح کاری ثابت نگه میدارد. سطح کار باید از جنس پلاستیک اکریلیک سفید و نیمهشفاف یا ماده مناسب دیگری با قابلیت عبور نور ۴۵ تا ۶۰ درصد باشد. طول و عرض سطح کار باید بهاندازهای باشد که امکان بررسی کامل یک فیله را فراهم کند؛ برای مثال، میتوان از یک صفحه به ابعاد ۳۰ × ۶۰ سانتیمتر و ضخامت ۵ تا ۷ میلیمتر استفاده کرد.
۳. منبع نور: منبع نور باید از نوع سفید خنک (Cool White) با دمای رنگ ۴۲۰۰ کلوین (°K) باشد. استفاده از حداقل دو لامپ فلورسنت ۲۰ واتی توصیه میشود. لامپها و اتصالات الکتریکی آنها باید بهگونهای طراحی و نصب شوند که از گرمشدن بیش از حد منبع نور جلوگیری شود. شدت متوسط نور در سطح کار باید ۱۵۰۰ تا ۱۸۰۰ لوکس باشد که این مقدار در فاصله ۳۰ سانتیمتری از مرکز صفحه اکریلیک اندازهگیری میشود. شدت روشنایی باید تقریباً با نسبت ۳:۱:۰٫۱ توزیع شود؛ بهطوریکه روشنایی ناحیه درست بالای منبع نور حدود سه برابر ناحیه بیرونی میدان دید باشد و روشنایی در خارجیترین محدوده میدان دید از ۰٫۱ روشنایی ناحیه داخلی بیشتر نباشد.نور محیط اتاق نیز باید بهاندازهای کم باشد که در شناسایی انگلها اختلال ایجاد نکند، اما نباید آنقدر تاریک باشد که باعث خستگی بیش از حد چشم شود.
معرفها
معرفهای مورد استفاده برای تثبیت و نگهداری نمونهها همان معرفهای ذکرشده در بخش «معرفهای موردنیاز برای بررسی انگل در مواد غذایی» هستند.
آمادهسازی نمونه
ابتدا وزن کل نمونه را اندازهگیری کرده و مقدار آن را در فرم گزارش آزمایش ثبت کنید.
فیله ماهی
اگر وزن فیلهها ۲۰۰ گرم یا بیشتر باشد، از یک فیله برای تهیه هر یک از ۱۵ زیرنمونه استفاده کنید. اگر وزن فیلهها کمتر از ۲۰۰ گرم باشد، فیلهها را بهصورت تصادفی انتخاب کنید تا ۱۵ زیرنمونه با وزن تقریبی ۲۰۰ گرم تهیه شود. وزن واقعی نمونه بررسیشده برای هر زیرنمونه را ثبت کنید.
اگر ضخامت فیلهها بیشتر از ۳۰ میلیمتر باشد، هر فیله را با استفاده از چاقوی تیز به دو قسمت با ضخامت تقریباً مساوی تقسیم کنید؛ ضخامت هر قسمت نباید بیشتر از ۳۰ میلیمتر باشد. سپس هر دو قسمت را مطابق روش شرحدادهشده در ادامه بررسی کنید.
اگر ضخامت فیله ۲۰ میلیمتر یا کمتر باشد، فیله را بهصورت کامل بررسی کنید.
بلوکهای ماهی
از دو بلوک ماهی که یخزدایی و آب اضافی آنها گرفته شده است، ۱۵ زیرنمونه بهصورت تصادفی انتخاب کنید. زیرنمونهها را مطابق روش توضیح دادهشده برای فیلهها آماده کنید.
هرگونه انگل مشاهدهشده در ماهی چرخشدهای که در اطراف زیرنمونهها به بلوک اضافه شده است، باید بهصورت جداگانه ثبت شود.
استیک، لاین و تکههای ماهی
این نمونهها را نیز مشابه فیله ماهی آماده کنید.
ماهی چرخشده
اگر ماهی چرخشده بهصورت بلوک منجمد شده باشد، از دو بلوک که یخزدایی و آب اضافی آنها گرفته شده است، ۱۵ زیرنمونه بهصورت تصادفی انتخاب کنید. زیرنمونهها را مطابق روش آمادهسازی فیلهها تهیه کنید و نمونهها را از قسمتهای مختلف بلوک انتخاب کنید.
اگر ماهی چرخشده بهصورت بلوک منجمد نشده باشد، ۱۵ قسمت ۲۰۰ گرمی را برای بررسی انتخاب کنید.
ماهی چرخشده را نباید بیشتر خرد یا ریزتر کنید.
ماهیهای سوخاری
محصولات منجمد را در دمای اتاق و داخل بشری با اندازه مناسب یخزدایی کنید.
پس از یخزدایی، محلول ۲ درصد سدیم لوریل سولفات (SLS) در آب با دمای ۵۰ درجه سانتیگراد را بهتدریج روی ماهی بریزید؛ به ازای هر ۳۰۰ گرم محصول، در هر مرحله ۱۰۰ میلیلیتر محلول اضافه کنید.
سپس به مدت ۱ دقیقه با استفاده از میله شیشهای هم بزنید. اجازه دهید نمونه حداقل ۱۰ دقیقه یا تا زمانی که پوشش سوخاری از بافت ماهی جدا شود، باقی بماند.
هر قطعه ماهی را روی یک الک شماره ۱۰ که روی الک شماره ۴۰ قرار گرفته است، منتقل کنید. پوشش سوخاری را با جریان ملایم آب گرم شیر از روی الک شماره ۱۰ شستوشو دهید.
الک شماره ۴۰ که پوشش سوخاری در آن جمع شده است را بهصورت دورهای با استفاده از نور فرابنفش (UV) بررسی کنید. انگلها در زیر این نور بهصورت فلورسنت دیده میشوند.
هر انگل مشاهدهشده را یادداشت کرده و در فرم گزارش آزمایش ثبت کنید.
برای دور ریختن پوشش سوخاری، الک شماره ۴۰ را با جریان معکوس آب شیر شستوشو دهید.
سپس قطعات ماهی را با استفاده از نور سفید و روش نوربینی بررسی کنید. اگر گوشت ماهی دارای رنگدانه باشد، از نور فرابنفش استفاده کنید.
بررسی نمونه
انگلهایی که در نزدیکی سطح گوشت قرار دارند، معمولاً به رنگهای قرمز، قهوهای مایل به زرد، کرم یا سفید گچی دیده میشوند. انگلهایی که در عمق بیشتری از بافت قرار گرفتهاند، به شکل سایه قابل مشاهده هستند.
نمونههای نماینده از انواع انگلها یا سایر موارد غیرطبیعی مشاهدهشده را جدا کنید. محل تقریبی، اندازه، شناسایی احتمالی و سایر مشاهدات مربوط به هر مورد را مطابق دستورالعمل ثبت کنید.
در مورد ماهی چرخشده، نمونه را روی میز نوربینی بهصورت لایهای با ضخامت ۲۰ تا ۳۰ میلیمتر پخش کنید و آن را بررسی کنید. برای بررسیهای توصیفی، نمونههای نماینده از انگلهای مشاهدهشده را انتخاب کنید.
بررسی با نور فرابنفش در ماهیهای با گوشت تیره
هر قطعه ماهی را، در صورت نیاز پس از جدا کردن پوشش سوخاری یا پوست، از هر دو طرف و با استفاده از چراغ رومیزی یا منبع نور مشابه بهصورت چشمی بررسی کنید. در صورت نیاز میتوان از چراغ رومیزی مجهز به ذرهبین نیز استفاده کرد. یافتههای حاصل از بررسی را مطابق دستورالعمل مربوطه ثبت کنید.
بررسی با نور فرابنفش باید در اتاق تاریکشده انجام شود. هر قطعه ماهی را از هر دو طرف و با استفاده از نور فرابنفش بازتابی با طول موج بلند (Longwave UV) و طول موج ۳۶۶ نانومتر بررسی کنید. انگلها در این طول موج معمولاً به رنگ آبی یا سبز فلورسنت دیده میشوند.
استخوانهای ماهی و بافتهای همبند نیز ممکن است به رنگ آبی فلورسنت دیده شوند؛ بااینحال، میتوان آنها را بر اساس شکل و پراکندگی منظم از انگلها افتراق داد. قطعات استخوان هنگام تماس با پروب یا ابزار بررسی، حالت سفت و سخت خود را حفظ میکنند.
⚠️ هشدار ایمنی
از قرار گرفتن چشم بدون محافظ در معرض نور فرابنفش، چه بهصورت مستقیم و چه بازتابشده، جداً خودداری کنید. هنگام کار با منابع نور فرابنفش، بهویژه در شرایطی که تابش بدون حفاظ است، استفاده از محافظ مناسب چشم الزامی است. از عینکهای محافظ تأییدشده متناسب با طول موج مورد استفاده، مانند عینکهای مخصوص UV یا محافظهای مناسب کار با این نوع تابش، استفاده کنید.
شناسایی انگل
انگلهای جداشده را مطابق روش توضیح دادهشده در بخش های قبلی تثبیت و برای شناسایی دقیقتر آماده کنید.
نوربینی فشاری برای شناسایی انگل در نرمتنان و سایر مواد غذایی نیمهشفاف
برخی مواد غذایی نیمهشفاف، مانند ماهیهای با گوشت سفید و صدفها، را میتوان با مشاهده شکل ظاهری انگل یا کپسول آن در نور عبوری، بهصورت چشمی بررسی کرد. روش نوربینی فشاری (Compression Candling) با هدف بررسی احشاء و عضلات صدف موجدار Spisula solidissima برای شناسایی نماتودهای Sulcascarisتوسعه یافته است، اما میتوان از آن برای بررسی سایر مواد غذایی و انگلها نیز استفاده کرد.
البته این روش قادر به شناسایی همه انگلها نیست؛ احتمالاً به این دلیل که برخی انگلها در سایه ایجادشده توسط بافت همبند پنهان میشوند. این روش در مقایسه با دو روش چشمی دیگر برای شناسایی نماتودها در اسکالوپ کالیکو Argopectin gibbus نیز بررسی شده است. در این مقایسه، نوربینی فشاری توانست تعداد بیشتری از نماتودها را شناسایی کند و موارد مثبت کاذب کمتری نسبت به دو روش دیگر ایجاد کرد.
تجهیزات و مواد مورد نیاز
۱. صفحات پلکسیگلاس لولادار: دو صفحه مربعی پلکسیگلاس به ابعاد ۳۰۵ × ۳۰۵ میلیمتر و ضخامت ⅜ اینچ را با یک لولای پیانویی به هم متصل کنید. بین دو صفحه باید حدود ۳ میلیمتر فاصله وجود داشته باشد که این فاصله با استفاده از شش پیچ ماشینی ایجاد میشود. اگر لولای پیانویی با اندازه مناسب در دسترس نباشد، میتوان از یک لولای یکاینچی استفاده و آن را برای ایجاد فاصله مناسب تنظیم کرد. همچنین برای حفظ فاصله ۳ میلیمتری، در دو انتهای یکی از صفحات و در سمت مقابل لولا، فاصلهدهندههای ۳ میلیمتری قرار دهید.
۲. جعبه نور
۳. چاقو
۴. ویال یا ظروف نگهداری نمونه
۵. سوزنهای تشریح
۶. پتری دیش
معرفها
1. محلول سالین فیزیولوژیک ۰٫۸۵ درصد
۲. اسید استیک گلاسیال
۳. اتانول ۷۰ درصد
روش انجام آزمایش
۱. بخشی از نمونه را روی سطح داخلی صفحه پلاستیکی پخش کنید. مقدار نمونهای که در هر مرحله بررسی میشود، به اندازه و ضخامت آن بستگی دارد. نمونههای با وزن بیش از ۱۰۰ گرم قابل فشردهسازی نیستند. نمونههای استوانهای، مانند اسکالوپها، را از طول به دو نیمه تقسیم کنید تا فشردهسازی آنها آسانتر شود.
۲. صفحه را ببندید و لبههای بیرونی آن را بهطور محکم به یکدیگر فشار دهید.
۳. هر دو طرف صفحه را با قرار دادن آن روی میز نور بررسی کنید. انگلهای موجود در بافت ماهی یا نرمتن بهصورت سایه دیده میشوند.
۴. تعداد انگلهای مشاهدهشده را ثبت کنید. برای تأیید وجود انگل، محل آن را با مداد مومی روی صفحه علامتگذاری کنید، سپس صفحه را باز کرده و با انجام تشریح، وجود انگل را بررسی کنید.
۵. برای تأیید هویت انگل، یک نمونه نماینده را مطابق روش توضیح دادهشده در بخش های قبلی تثبیت کنید.
تخریب مکانیکی و تهنشینی برای شناسایی انگلهای لاروی در بافت ماهی
این روش برای شناسایی لاروهای آنیزاکید (Anisakids) در بافت فیله ماهی به کار میرود. استفاده از این روش برای ماهیهایی که بدون خارج کردن استخوان، تحت فرایند نمکسود شدن قرار گرفتهاند، مانند شاهماهی ترشیشده، مناسب نیست و بهطور کلی ممکن است برای گونههایی مانند شاهماهی نیز کاربرد نداشته باشد.
وزن هر زیرنمونهای که در دستگاه غذاساز قرار میگیرد نباید بیشتر از ۲۰۰ گرم باشد؛ بااینحال، میتوان چند زیرنمونه را برای انجام آنالیز نهایی با یکدیگر ترکیب کرد.
مواد و تجهیزات
۱. غذاساز؛ مانند مدل Cuisinart DLC 10، مدل Moulinex 663 یا دستگاه معادل
۲. سینی شیشهای، به ابعاد ۳۵۰ × ۲۵ × ۶۰ میلیمتر
۳. بشر ۱۰۰۰ میلیلیتری
۴. لامپ فلورسنت سفید
۵. لامپ فرابنفش با طول موج کمتر از ۳۶۵ نانومتر یا منبع نور مشابه
۶. محافظ مناسب چشم
۷. میله شیشهای
۸. پنس
۹. ویال یا ظروف نگهداری نمونه
۱۰. ماده تثبیتکننده
روش انجام آزمایش
ابتدا فیله و پوست ماهی را جدا کرده و سپس وزن کنید. نمونه را در غذاساز قرار دهید و سری پلاستیکی خمیرزن دستگاه را نصب کنید. مقدار آبی با دمای ۳۵ درجه سانتیگراد، معادل دو برابر وزن ماهی، به نمونه اضافه کنید.
دستگاه را بهصورت متناوب روشن کنید تا بافت ماهی کاملاً از هم جدا شود؛ این مرحله معمولاً ۱ تا ۲ دقیقه زمان میبرد.
محتویات را داخل بشر بریزید و ۳۰ تا ۶۰ ثانیه صبر کنید. سپس تمام مایع رویی را بهجز ۱۰۰ میلیلیتر تخلیه کنید.
دوباره آب اضافه کرده و نمونه را هم بزنید. پس از ۳۰ تا ۶۰ ثانیه، مجدداً مایع رویی را تا باقی ماندن ۱۰۰ میلیلیتر تخلیه کنید. این مرحله را دو بار تکرار کنید.
حدود ۲۵ میلیلیتر از رسوب را در سینی شیشهای بریزید و با افزودن آب، آن را تا رسیدن به حالت کاملاً نیمهشفاف یا رسیدن عمق نمونه به ۱۰ میلیمتر رقیق کنید؛ برای این کار تقریباً ۳۷۵ میلیلیتر آب مورد نیاز است.
سپس انگلها را بررسی، جمعآوری یا شمارش کنید. همزدن رسوب با استفاده از پنس میتواند به بازیابی انگلها کمک کند و پنس برای جمعآوری آنها نیز کاربرد دارد.
حرکت انگلها را ثبت کنید. بخشی نماینده از انگلهای موجود را برای شناسایی جمعآوری و تثبیت کنید؛ روش تثبیت مطابق بخش های قبلی است.
نمونه را زیر نور فرابنفش موجکوتاه (Shortwave UV) با طول موج حدود ۳۶۵ نانومتر و شدت بیش از ۵۰۰ میکرووات بر سانتیمتر مربع بررسی کنید. انگلها در این شرایط معمولاً به رنگ آبی یا زرد مایل به سبز فلورسنت دیده میشوند.
تعداد انگلهای مشاهدهشده را شمارش و ثبت کنید. سپس مراحل را از قسمت مشخصشده با علامت (*) تکرار کنید تا کل نمونه بررسی شود.
تغلیظ کرمهای انگلی و تکیاختهها از سبزیجات
سبزیجات ممکن است در اثر تماس با مدفوع انسان یا حیوان یا در نتیجه استفاده از کودهای کشاورزی تهیهشده از فاضلاب، به موجودات انگلی آلوده شوند. روش زیر برای بررسی سبزیجات تازه از نظر وجود انگلها قابل استفاده است.
در یک روش مشابه، Cryptosporidium sp. از ۱ درصد نمونههای آب بررسیشده بازیابی شد. بر اساس این روش، میزان بازیابی Cryptosporidium از سبزیجات حدود ۱ درصد یا کمتر برآورد شده است. هر نمونه شامل پنج زیرنمونه یک کیلوگرمی است.
تجهیزات و مواد مورد نیاز
۱. ترازو
۲. بشر پلیپروپیلنی، ۱ لیتری
۳. حمام اولتراسونیک با ظرفیت حدود ۲ لیتر
۴. سانتریفیوژ با ظرفیت بالا، سرعت پایین و روتور سطلی چرخان
۵. لولههای سانتریفیوژ پلیپروپیلنی، ۵۰ میلیلیتری
۶. قطرهچکان پلیپروپیلنی
۷. پلیت کشت دارای شبکه ۲ میلیمتری
۸. لام میکروسکوپی
معرفها
۱. ید لوگول (Lugol’s iodine)
۲. محلول شیتر (Sheather’s fluid) شامل ۵۰۰ گرم ساکاروز، ۳۲۰ میلیلیتر آب دییونیزه و ۶٫۵ گرم فنل
۳. محلولهای شوینده شماره ۱، ۲ و ۳:
- محلول شماره ۱: فرمالدهید ۲٫۵ درصد، سدیم دودسیل سولفات (SDS) ۰٫۱ درصد و Tween 80 به میزان ۰٫۱ درصد
- محلول شماره ۲: Tween 80 به میزان ۱ درصد و SDS به میزان ۱ درصد
- محلول شماره ۳: Tween 80 به میزان ۱ درصد
۴. کیت آنتیبادی فلورسنت
روش انجام آزمایش
۱. آمادهسازی و شستوشوی سبزیجات برای آزمایش
پیش از انجام آزمایش، سبزیجات را در یخچال نگهداری کنید.
سبزیجات را بر اساس نوع به واحدهای مناسب تقسیم کنید:
سبزیجات دارای کُپه یا سرِ فشرده، مانند کلم: سه لایه بیرونی برگها را جدا کنید.
سبزیجات با برگهای باز، مانند کاهوی برگی: برگها را از یکدیگر جدا کنید.
سبزیجات ریشهای، مانند هویج: نیازی به آمادهسازی اولیه ندارند.
سبزیجات گلچهای، مانند گلکلم: به گلچههایی حدود ۵۰ گرم تقسیم کنید.
حدود ۱ تا ۱٫۵ لیتر محلول شوینده شماره ۱ را داخل حمام اولتراسونیک ریخته و سبزیجات را بهصورت آزاد و تا حدود ۲۵۰ گرم در آن قرار دهید. دستگاه را ۱۰ دقیقه روشن کنید. سبزیجات را یکییکی خارج کرده و اجازه دهید آب اضافی آنها خارج شود. این فرایند را از مرحله (*) تکرار کنید تا تمام زیرنمونه تحت امواج اولتراسونیک قرار گیرد.
۲. سانتریفیوژ و آمادهسازی نمونه برای آزمایش
محلول شوینده را به بشر منتقل و سپس در لولههای سانتریفیوژ ۵۰ میلیلیتری توزیع کنید. نمونهها را با نیروی ۱۲۰۰ × g به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ کنید. مایع رویی را خارج کرده و ۱٫۵ تا ۲ میلیلیتر از آن را باقی بگذارید. رسوب لولهها را با قطرهچکان یا پیپت پلاستیکی در یک لوله واحد جمع کنید.
هر لوله را دو بار با ۱٫۵ میلیلیتر محلول شوینده شماره ۲ شستوشو داده و محلول شستوشو را به لوله حاوی رسوب منتقل کنید. سپس رسوب را دو بار با محلول شماره ۲ شستوشو داده و سانتریفیوژ کنید.
حجم نمونه را با محلول شوینده شماره ۳ به ۱۰ میلیلیتر رسانده و ۱۰ دقیقه تحت امواج اولتراسونیک قرار دهید. ۲۵ میلیلیتر محلول شیتر را در یک لوله سانتریفیوژ تمیز ریخته و سوسپانسیون حاصل را بهصورت لایهای روی آن اضافه کنید. نمونه را با نیروی ۱۲۰۰ × g به مدت ۳۰ دقیقه سانتریفیوژ کنید.
۷ میلیلیتر از مایع موجود در سطح تماس دو لایه را برداشته و به یک لوله سانتریفیوژ منتقل کنید. لوله را با محلول شوینده شماره ۳ پر کرده و با نیروی ۱۲۰۰ × g به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ کنید. مایع رویی را خارج کرده و رسوب را با محلول شوینده شماره ۳ رقیق کنید؛ سپس ۱۰ دقیقه با نیروی ۱۲۰۰ × g سانتریفیوژ کنید. این مرحله را دو بار دیگر تکرار کنید.
بررسی تخم کرمهای انگلی
برای بررسی تخم کرمهای انگلی، رسوب را به یک پلیت منتقل کرده و ۱ میلیلیتر ید لوگول به آن اضافه کنید.
نمونه را رقیق کرده و کل سطح پلیت را با استفاده از میکروسکوپ معکوس بررسی کنید.
بررسی تکیاختهها
برای بررسی تکیاختهها، رسوب را با محلول شوینده شماره ۳ به اندازهای رقیق کنید که به حالت نیمهشفاف برسد. سپس ۱۰۰ میکرولیتر از نمونه رقیقشده را بهصورت یک اسمیر نازک روی لام میکروسکوپی تمیز و پوششدادهشده با پلی-L-لیزین (Poly-L-lysine) تهیه کنید.
اجازه دهید لامها در هوای محیط خشک شوند. نمونههای کنترل مثبت و منفی را نیز در چاهک یا لامهای جداگانه اضافه کرده و اجازه دهید خشک شوند.
رنگآمیزی با آنتیبادی فلورسنت را مطابق دستورالعمل شرکت سازنده کیت انجام دهید.
هر لام را با بزرگنمایی ۲۰۰ تا ۳۰۰ برابر و با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت بررسی کرده و نتایج را ثبت کنید.
اگر نتیجه آزمایش مثبت باشد، تعداد کیستهای موجود در هر کیلوگرم نمونه غذایی را با اندازهگیری حجم سوسپانسیون باقیمانده و برآورد تعداد کیستها محاسبه کنید.
اگر نتیجه منفی باشد، رسوب باقیمانده را نیز رنگآمیزی کرده و مورد بررسی قرار دهید.
سخن پایانی
وجود انگل در مواد غذایی یکی از عوامل مؤثر بر سلامت و ایمنی مواد غذایی است. انگلها میتوانند از طریق آب و خاک آلوده، فاضلاب، کودهای حاوی مواد دفعی انسانی یا حیوانی و مصرف مواد غذایی خام یا نیمپز وارد زنجیره غذایی شوند. برخی انگلها بدون ایجاد علائم از بدن عبور میکنند، اما برخی دیگر موجب بیماری و عوارض جدی میشوند.
شناسایی انگلها در مواد غذایی به دلیل تنوع گونهها و تفاوت ساختار نمونهها، به روشهای آزمایشگاهی متناسب با نوع ماده غذایی و انگل احتمالی نیاز دارد. در این مقاله، روشهای بررسی آلودگی انگلی مواد غذایی، از جمله هضم بافت، نوربینی در ماهیان بالهدار، نوربینی فشاری در نرمتنان و مواد غذایی نیمهشفاف، تخریب مکانیکی و تهنشینی در گوشت ماهی و روش تغلیظ انگلهای انگلی و تکیاختهها از سبزیجات بررسی میشود.
انتخاب روش مناسب، آمادهسازی و تغلیظ نمونه و در نهایت بررسی میکروسکوپی و شناسایی تکمیلی، از مراحل مهم ارزیابی آلودگی انگلی هستند. از آنجا که یک روش واحد برای شناسایی همه انگلها و مواد غذایی مناسب نیست، روش آزمایش باید بر اساس نوع نمونه، ساختار ماده غذایی و نوع انگل احتمالی انتخاب شود.
در مجموع، اجرای صحیح روشهای آزمایشگاهی برای شناسایی انگل در مواد غذایی میتواند به تشخیص آلودگی، ارزیابی ایمنی مواد غذایی و پیشگیری از انتقال بیماریهای انگلی کمک کند. این فرایند باید توسط افراد آموزشدیده و در شرایط کنترلشده آزمایشگاهی انجام شود.
