استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم: راهنمای جامع اصول و نکات مهم آزمایشگاهی

با وجود توسعه روش‌های جدید مانند کیت‌های استخراج مبتنی بر ستون‌های سیلیکا و ذرات مغناطیسی، استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم همچنان به‌عنوان یک روش اقتصادی و قابل اعتماد برای دستیابی به DNA با کیفیت بالا شناخته می‌شود.

استخراج DNA یکی از مهم‌ترین مراحل در بسیاری از آزمایش‌های زیست‌شناسی مولکولی است. کیفیت و خلوص  DNA استخراج‌شده، تأثیر مستقیمی بر موفقیت آزمایش‌هایی مانند PCR، کلونینگ، هضم آنزیمی، توالی‌یابی و مطالعات ژنتیکی دارد.

در ادامه این مقاله قصد داریم به بررسی این روش و نکات مهم در رابطه با آن بپردازیم. پس با ما همراه باشید.

آشنایی با روش ، استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم

روش فنل-کلروفرم (Phenol-Chloroform Method) یکی از روش‌های کلاسیک و پرکاربرد برای استخراج DNA است. این روش بر اساس تفاوت حلالیت مولکول‌های زیستی در فازهای آبی و آلی عمل می‌کند.

در این تکنیک، سلول‌ها ابتدا شکسته می‌شوند تا محتویات داخلی آن‌ها آزاد شود. سپس مخلوط حاصل با محلولی شامل فنل، کلروفرم و ایزوآمیل الکل ترکیب می‌شود. در این مرحله، پروتئین‌ها و سایر ترکیبات سلولی به فاز آلی منتقل می‌شوند، در حالی که DNA و RNA در فاز آبی باقی می‌مانند.

پس از جداسازی دقیق فاز آبی،DNA  موجود در آن با استفاده از نمک‌ها و اتانول رسوب داده می‌شود. در نهایت، رسوب DNA جمع‌آوری شده و برای استفاده‌های بعدی خالص‌سازی و نگهداری می‌شود.

روش استخراج DNA  به روش فنل-کلروفرم به دلیل توانایی بالا در تولید DNA با وزن مولکولی زیاد و خلوص مناسب، همچنان در بسیاری از آزمایشگاه‌های تحقیقاتی مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش به‌ویژه برای کاربردهایی مانند نقشه‌برداری ژنتیکی، ساخت کتابخانه‌های ژنی، کلونینگ و توالی‌یابی DNA اهمیت دارد.

معرف‌های مورد استفاده در استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم

در این روش، مجموعه‌ای از معرف‌ها برای تخریب سلول‌ها، حذف پروتئین‌ها، جلوگیری از تخریب DNA و رسوب‌دهی اسیدهای نوکلئیک استفاده می‌شوند. هر یک از این ترکیبات نقش مشخصی در فرآیند استخراج دارند. در جدول زیر به بررسی این موارد پرداخته شده است.

اصول پایه استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم ، چگونه DNA از سایر ترکیبات سلولی جدا می‌شود؟

معیار اصلی استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم بر اساس تفاوت حلالیت ترکیبات زیستی در دو محیط آبی و آلی است.

فنل (Phenol) یک حلال آلی قطبی است که ساختار سه‌بعدی پروتئین‌ها را تغییر می‌دهد. این ماده با ایجاد اختلال در پیوندهای هیدروژنی و برهم‌کنش‌های آب‌گریز، باعث دناتوره شدن پروتئین‌ها می‌شود.

پس از اضافه شدن فنل به نمونه لیزشده، پروتئین‌های دناتوره‌شده به سمت فاز آلی حرکت می‌کنند. در مقابل،  DNA  و RNA به دلیل داشتن اسکلت فسفاتی با بار منفی، در محیط آبی باقی می‌مانند.

مولکول‌های آب اطراف گروه‌های فسفات DNA، باعث پایدار ماندن این ساختار شده و از انتقال آن به فاز آلی جلوگیری می‌کنند.

کلروفرم (Chloroform) نقش مهمی در ایجاد یک جداسازی واضح بین دو فاز دارد. این ماده باعث تشکیل مرز مشخص‌تر میان فاز آبی و فاز آلی می‌شود و حذف ناخالصی‌ها را آسان‌تر می‌کند.

ایزوآمیل الکل (Isoamyl alcohol) نیز برای کاهش تشکیل کف هنگام مخلوط کردن نمونه به کار می‌رود. وجود کف می‌تواند جداسازی فازها را دشوار کرده و باعث کاهش کیفیت استخراج شود.

پس از جداسازی فاز آبی، DNA با افزودن نمک‌هایی مانند سدیم استات و سپس اتانول رسوب داده می‌شود. یون‌های سدیم بار منفی DNA را خنثی کرده و شرایط لازم برای تجمع مولکول‌های DNA را فراهم می‌کنند.

در نهایت، رسوب DNA جمع‌آوری، شستشو و در بافر مناسب مانند TE حل می‌شود.. DNA حاصل می‌تواند برای بسیاری از کاربردهای حساس زیست‌شناسی مولکولی مورد استفاده قرار گیرد .

مراحل و پروتکل استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم

روش فنل-کلروفرم شامل چند مرحله اصلی است که هدف هر مرحله، حذف ترکیبات مزاحم و حفظ DNA با بیشترین میزان خلوص و یکپارچگی است. این مراحل شامل آماده‌سازی نمونه، لیز سلولی، استخراج با حلال‌های آلی، رسوب‌دهی DNA و بازیابی نهایی آن می‌شود.

۱. آماده‌سازی نمونه  (Sample Preparation)

اولین مرحله در استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم، آماده‌سازی مناسب نمونه است. نوع نمونه مورد استفاده می‌تواند بر روند استخراج تأثیر زیادی داشته باشد. نمونه‌های مایع زیستی، محیط‌های کشت و بافت‌های جامد، هرکدام نیازمند آماده‌سازی متفاوتی هستند.

آماده‌سازی نمونه‌های مایع زیستی و محیط‌های کشت

برای نمونه‌های مایع زیستی یا محیط کشت، ابتدا مقدار ۷ میلی‌لیتر از نمونه به لوله‌ای منتقل می‌شود که از قبل حاوی ۰.۵۱ میلی‌لیتر EDTA با غلظت ۰.۶ مولار است.

وجود EDTA در این مرحله اهمیت زیادی دارد؛ زیرا با اتصال به یون‌های فلزی دوظرفیتی مانند منیزیم و کلسیم، فعالیت آنزیم‌های DNase را کاهش می‌دهد. این آنزیم‌ها می‌توانند باعث تخریب DNA شوند.

سپس نمونه به مدت ۱۵ دقیقه با نیروی گریز از مرکز 15,000g سانتریفیوژ می‌شود. پس از پایان سانتریفیوژ، مایع رویی (Supernatant) به‌آرامی خارج می‌شود و رسوب سلولی باقی می‌ماند.

اگر پس از سانتریفیوژ، رسوب سلولی قابل مشاهده نباشد، می‌توان این مرحله را دوباره تکرار کرد تا مقدار کافی از سلول‌ها جمع‌آوری شود.

آماده‌سازی نمونه‌های بافتی

در نمونه‌های بافتی، ابتدا قطعات کوچک بافت به بافر استخراج اضافه می‌شوند.

بافر استخراج معمولاً شامل ترکیبات زیر است:

• 50 میلی‌مولار Tris-Cl با pH=8.0
• 100 میلی‌مولار NaCl
• 10 میلی‌مولار EDTA
• 0.5 درصد SDS
• 0.2 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر پروتئیناز K
• 1 درصد 2-مرکاپتواتانول

نمونه بافتی باید به‌خوبی همگن شود. برای این کار می‌توان از هاون استفاده کرد.

فرآیند همگن‌سازی باید روی یخ انجام شود تا از افزایش دما و تخریب DNA جلوگیری شود. همچنین باید از ایجاد کف زیاد جلوگیری کرد؛ زیرا کف می‌تواند باعث آسیب مکانیکی به مولکول‌های DNA و کاهش کیفیت استخراج شود.

در نمونه‌های گیاهی، وجود ترکیباتی مانند پلی‌ساکاریدها و پلی‌فنول‌ها ممکن است در مراحل بعدی ایجاد مشکل کند. به همین دلیل، آماده‌سازی دقیق نمونه اهمیت بیشتری دارد.

۲. لیز سلولی (Cell Lysis)در استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم

پس از آماده‌سازی نمونه در روش استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم، مرحله لیز سلولی آغاز می‌شود. هدف این مرحله، شکستن غشای سلولی و هسته‌ای و آزادسازی DNA موجود در سلول است.

اگر نمونه قرار باشد برای مدت کوتاهی نگهداری شود، ابتدا رسوب سلولی در ۵۰۰ میکرولیتر PBS حل می‌شود.

سپس:

• ۷۰۰ میکرولیتر از بافر لیزکننده حاوی SDS و پروتئیناز K اضافه می‌شود.
• نمونه به مدت حدود ۱ دقیقه ورتکس (Vortex) می‌شود.

SDS  موجود در بافر لیز، غشاهای چربی سلول را تخریب می‌کند و باعث آزاد شدن محتویات داخلی سلول می‌شود.

پروتئیناز K نیز پروتئین‌های متصل به DNA را تجزیه می‌کند. این آنزیم به‌خصوص برای حذف پروتئین‌های هسته‌ای مانند هیستون‌ها اهمیت دارد.

حذف RNA از نمونه

پس از لیز سلولی، برای جلوگیری از آلودگی DNA با RNA، آنزیم RNase A به نمونه اضافه می‌شود. مقدار معمول5  میکرولیتر RNase A با غلظت ۱۰ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر  است. سپس نمونه به مدت ۴۵ دقیقه در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه می‌شود.

در طول انکوباسیون، هر ۱۰ دقیقه یک‌بار لوله به‌آرامی سر و ته می‌شود تا ترکیبات به‌خوبی مخلوط شوند.

RNase A مقدار RNA  موجود در نمونه را تجزیه می‌کند و باعث افزایش خلوص DNA نهایی می‌شود.

۳. استخراج با فنل-کلروفرم جداسازی DNA از پروتئین‌ها و ناخالصی‌ها

در این مرحله، محلول لیزشده با مخلوط فنل، کلروفرم و ایزوآمیل الکل ترکیب می‌شود.

نسبت استاندارد این ترکیب به صورت زیر است:

فنل : کلروفرم : ایزوآمیل الکل = 25 : 24 : 1

به نمونه، حجمی برابر با حجم محلول لیزشده از این ترکیب اضافه می‌شود. برای مثال، اگر حجم محلول لیزشده ۱ میلی‌لیتر باشد، مقدار ۱ میلی‌لیتر از مخلوط فنل-کلروفرم اضافه خواهد شد. پس از افزودن محلول آلی، لوله باید به‌آرامی و با سر و ته کردن مخلوط شود. مدت زمان مخلوط کردن حدود ۳۰ ثانیه است.

توجه داشته باشید که باید از ورتکس شدید در این مرحله اجتناب گردد؛ زیرا می‌تواند منجربه شکسته شدن رشته‌های بلند DNA شود.

پس از مخلوط کردن، نمونه به مدت ۵ دقیقه با سرعت 16,000 تا 18,000 g در دمای اتاق سانتریفیوژ می‌شود.

پس از سانتریفیوژ، سه بخش اصلی تشکیل می‌شود:

۱. فاز آلی (Organic Phase)

این فاز در قسمت پایین لوله قرار می‌گیرد و حاوی مواد زیر است:

• فنل
• کلروفرم
• پروتئین‌های دناتوره‌شده
• ترکیبات آب‌گریز سلولی

۲. لایه میانی یا اینترفاز (Interphase)

این بخش معمولاً به شکل یک لایه سفیدرنگ دیده می‌شود  و حاوی مواد زیر است:

• بقایای پروتئینی
• ذرات سلولی
• ترکیبات دناتوره‌شده

۳. فاز آبی (Aqueous Phase)

این فاز در قسمت بالایی لوله قرار دارد و حاوی موارد زیر سات:

• DNA
• RNA باقی‌مانده
• ترکیبات محلول در آب

توجه داشته باشید که فاز آبی باید با دقت بالا و بدون برداشت از لایه میانی، به یک لوله جدید منتقل شود.

برای افزایش خلوص DNA، مرحله استخراج با فنل-کلروفرم معمولاً ۲ تا ۳ بار تکرار می‌شود تا لایه میانی کاملاً شفاف شود.

4. خالص‌سازی نهایی و آماده‌سازی DNA برای جمع‌آوری

در روش استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم ، پس از انتقال فاز آبی، هنوز ممکن است مقدار کمی فنل در محلول باقی مانده باشد. وجود فنل می‌تواند در واکنش‌های آنزیمی مانند  PCR، هضم آنزیمی و سایر کاربردهای زیست‌شناسی مولکولی اختلال ایجاد کند. به همین دلیل، باید قبل از رسوب‌دهی DNA، مرحله حذف فنل انجام شود.

برای حذف باقی‌مانده فنل، حجمی برابر با حجم فاز آبی، کلروفرم ۱۰۰ درصد به نمونه اضافه می‌شود.

پس از افزودن کلروفرم:

• نمونه به‌آرامی با سر و ته کردن مخلوط می‌شود.
• سپس مانند مرحله قبل سانتریفیوژ انجام می‌شود.

کلروفرم باعث انتقال فنل باقی‌مانده به فاز آلی می‌شود و کمک می‌کند DNA موجود در فاز آبی خالص‌تر شود.

پس از سانتریفیوژ، فاز آبی جدید به‌آرامی جدا شده و برای مرحله رسوب‌دهی آماده می‌شود.

برای رسوب دادن DNA، ابتدا به فاز آبی منتقل‌شده، یک‌دهم حجم محلول، سدیم استات ۳ مولار با pH=5.2  و دو برابر حجم محلول، اتانول ۱۰۰ درصد سرد اضافه می‌شود.

سدیم استات نقش مهمی در این مرحله دارد. یون‌های سدیم (Na⁺) با خنثی کردن بار منفی گروه‌های فسفات DNA، باعث کاهش حلالیت DNA در محیط آبی می‌شوند.

اتانول نیز با کاهش قطبیت محیط، شرایط لازم برای تجمع مولکول‌های DNA را فراهم می‌کند.

پس از افزودن مواد، نمونه به‌آرامی مخلوط شده و به مدت ۲۰ دقیقه روی یخ انکوبه می‌شود. در این مرحله، DNA به صورت توده‌ای قابل مشاهده یا رسوب سفیدرنگ تشکیل می‌شود.

۵. بازیابی: جمع‌آوری، شستشو و حل کردن رسوب DNA

پس از تشکیل رسوب  DNA، نمونه باید سانتریفیوژ شود تا DNA در کف لوله جمع‌آوری شود. شرایط سانتریفیوژ ۱۵ دقیقه با سرعت 16,000 g و دمای ۴ درجه سانتی‌گراد است. پس از پایان سانتریفیوژ، مایع رویی به‌آرامی خارج می‌شود. رسوب DNA که به شکل یک Pellet در کف لوله قرار دارد، باید با دقت حفظ شود.

برای حذف نمک‌ها و ناخالصی‌های باقی‌مانده، رسوب DNA دو بار با اتانول ۷۰ درصد سرد شستشو داده می‌شود. در این مرحله، اتانول باعث حذف نمک‌های باقی‌مانده، ترکیبات آلی و بقایای معرف‌های استخراج می‌شود.پس از شستشو، رسوب DNA باید برای مدت کوتاهی در معرض هوا خشک شود. زمان خشک شدن حداکثر ۱۰ دقیقه است.

خشک شدن بیش از حد DNA توصیه نمی‌شود.زیرا می‌تواند باعث سخت شدن رسوب و کاهش قابلیت حل شدن مجدد آن شود. پس از خشک شدن، رسوب DNA در ۵۰ میکرولیتر بافر TE حل می‌شود. بافر TE معمولاً شامل۱۰ میلی‌مولار Tris-Cl با pH=8.0 و۱ میلی‌مولار EDTA است

Tris باعث حفظ pH مناسب برای پایداری DNA می‌شود.. EDTA نیز با اتصال به یون‌های فلزی، فعالیت نوکلئازها را مهار کرده و از تخریب DNA جلوگیری می‌کند.

 DNA استخراج‌شده معمولاً در دمای منفی ۲۰ درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌شود.

۶. پاک‌سازی اختیاری در روش استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم

در استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم، در برخی نمونه‌ها، مقدار زیادی پروتئین یا ترکیبات مزاحم همراه  DNA  وجود دارد. در این شرایط، می‌توان قبل از مرحله رسوب‌دهی با اتانول، یک مرحله استخراج اضافی با فنل-کلروفرم انجام داد.

این مرحله باعث می‌شود:

• پروتئین‌های باقی‌مانده حذف شوند.
• خلوص DNA افزایش یابد.
• کیفیت DNA برای آزمایش‌های حساس بهتر شود.

این اصلاح بیشتر در نمونه‌هایی کاربرد دارد که دارای مقدار زیادی پروتئین، بقایای سلولی یا ترکیبات مهارکننده هستند.

اصلاحات روش استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم

اگرچه روش کلاسیک استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم همچنان کاربرد گسترده‌ای دارد، اما اصلاحات جدید باعث افزایش کارایی آن شده‌اند. این تغییرات به‌خصوص برای نمونه‌هایی با مقدار کم DNA یا نمونه‌هایی که استخراج آن‌ها دشوار است، اهمیت دارند. در ادامه به بررسی اصلاحات خواهیم پرداخت.

۱. رسوب‌دهی با کمک حامل(Carrier-aided precipitation)

در نمونه‌هایی که مقدار DNA بسیار کم است، ممکن است رسوب DNA به‌راحتی قابل مشاهده نباشد یا مقدار زیادی از DNA در مرحله رسوب‌دهی از دست برود.

برای حل این مشکل، می‌توان از ترکیباتی مانند گلیکوژن (Glycogen) و پلی‌آکریل‌آمید خطی (Linear polyacrylamide)  به عنوان حامل استفاده کرد. این مواد به تجمع DNA کمک کرده و باعث افزایش میزان بازیابی DNA از نمونه‌های کم‌غلظت می‌شوند .

۲. جایگزینی ایزوپروپانول(Isopropanol substitution)

در برخی شرایط، به جای اتانول می‌توان از ایزوپروپانول یا ۲-پروپانول استفاده کرد .استفاده از حدود  ۰.۷ برابر حجم محلول DNA از ایزوپروپانول می‌تواند سرعت رسوب‌دهی DNA را افزایش دهد. این روش به‌خصوص در محلول‌های رقیق‌شده و نمونه‌هایی با غلظت پایین DNA مفید است.

۳. جداسازی DNA با ذرات مغناطیسی  (Magnetic bead capture)

یکی از اصلاحات جدید، استفاده از ذرات مغناطیسی با پوشش سیلیکا است.

در این روش DNA پس از لیز سلولی به ذرات مغناطیسی متصل می‌شود. ناخالصی‌ها شسته می‌شوند. DNA خالص بازیابی می‌شود. این روش نیاز به مراحل متعدد سانتریفیوژ را کاهش می‌دهد و امکان اتوماسیون فرآیند استخراج را فراهم می‌کند .

۴. پیش‌تیمار CTAB برای نمونه‌های گیاهی (CTAB pre-treatment for plant tissues)

نمونه‌های گیاهی معمولاً دارای ترکیباتی مانند پلی‌ساکاریدها، پلی‌فنول‌ها و ترکیبات ثانویه گیاهی هستند که می‌توانند در استخراج DNA اختلال ایجاد کنند. برای این نمونه‌ها، استفاده از CTAB پیش از استخراج فنل-کلروفرم توصیه می‌شود. CTAB با DNA کمپلکس نامحلول تشکیل می‌دهد. این کمپلکس سپس در حضور NaCl یک مولار حل شده و برای ادامه استخراج آماده می‌شود. این روش باعث حذف بهتر ترکیبات مزاحم گیاهی و افزایش کیفیت DNA نهایی می‌شود .

عیب‌یابی استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم، مشکلات رایج، دلایل ایجاد و راهکارهای اصلاح

اگرچه روش استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم یکی از روش‌های قابل اعتماد برای استخراج DNA با کیفیت بالا است، اما در برخی شرایط ممکن است مشکلاتی در روند استخراج ایجاد شود. عواملی مانند کیفیت نمونه، نحوه انجام مراحل، نسبت معرف‌ها، شدت مخلوط کردن و شرایط نگهداری می‌توانند بر مقدار و کیفیت DNA نهایی تأثیر بگذارند. در ادامه، رایج‌ترین مشکلات این روش، علت احتمالی آن‌ها و راهکارهای پیشنهادی برای رفع مشکل بررسی شده است.

چگونه کیفیت DNA نهایی بررسی می‌شود؟

پس از پایان استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم ، بررسی کیفیت DNA اهمیت زیادی دارد. DNA  استخراج‌شده باید از نظر مقدار، خلوص و سلامت ساختاری ارزیابی شود تا مشخص شود برای آزمایش‌های بعدی مناسب است یا خیر.

سه روش اصلی برای ارزیابی DNA استخراج‌شده عبارت‌اند از:

۱. اسپکتروفتومتری(Spectrophotometry)

یکی از رایج‌ترین روش‌ها برای بررسی کیفیت DNA، اندازه‌گیری جذب نوری نمونه است.

در این روش، میزان جذب DNA در طول موج‌های مختلف بررسی می‌شود.

مهم‌ترین نسبت‌های مورد بررسی، نسبت A260/A280است. این نسبت برای بررسی آلودگی پروتئینی استفاده می‌شود. مقدار مناسب برای DNA خالص معمولاً حدود ۱.۸ استمقادیر پایین‌تر از این عدد می‌توانند نشان‌دهنده حضور پروتئین یا سایر ترکیبات جذب‌کننده نور در نمونه باشند.

نسبت A260/A230 نیز برای بررسی وجود ترکیباتی مانند فنل، نمک‌ها، پلی‌ساکاریدها و سایر آلاینده‌های آلی استفاده می‌شود. مقدار مناسب معمولاً بزرگ‌تر یا مساوی ۲ در نظر گرفته می‌شود. مقدار کمتر از این میزان می‌تواند نشان‌دهنده آلودگی نمونه باشد.

۲. الکتروفورز ژل آگارز(Agarose Gel Electrophoresis)

الکتروفورز ژل آگارز یکی از روش‌های مهم برای بررسی سلامت ساختاری DNA است. در این روش، نمونه DNA روی ژل آگارز قرار داده شده و تحت میدان الکتریکی حرکت داده می‌شود. برای بررسی DNA ژنومی معمولاً از ژل آگارز ۰.۸ درصد استفاده می‌شود. DNA  با وزن مولکولی بالا باید به صورت یک باند واضح در قسمت بالایی ژل با حداقل میزان پخش‌شدگی (Smearing) مشاهده شود. وجود smear گسترده معمولاً نشان‌دهنده شکستگی یا تخریب DNA است .

۳. اندازه‌گیری فلورومتری(Fluorometric Quantification)

برای اندازه‌گیری دقیق مقدار DNA، به‌خصوص در نمونه‌هایی با غلظت پایین، می‌توان از روش‌های فلورومتری استفاده کرد. یکی از روش‌های رایج، استفاده از کیت  Qubit dsDNA HS است. این روش نسبت به اسپکتروفتومتری اختصاصیت بیشتری برای DNA دو رشته‌ای دارد و می‌تواند مقدار واقعی DNA موجود در نمونه را با دقت بالاتری اندازه‌گیری کند. این روش به‌خصوص برای نمونه‌های ارزشمند یا کم‌بازده کاربرد زیادی دارد

نکات ایمنی و اقدامات احتیاطی در روش فنل-کلروفرم

استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم به دلیل استفاده از مواد شیمیایی خطرناک، نیازمند رعایت دقیق اصول ایمنی است. فنل و کلروفرم هر دو ترکیباتی سمی هستند و تماس مستقیم یا استنشاق بخارات آن‌ها می‌تواند خطرناک باشد. در ادامه به بررسی نکات ایمنی مهم حین استفاده از این روش خواهیم پرداخت.

۱. استفاده از تجهیزات حفاظت فردی در استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم

حین استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم  و هنگام کار با فنل و کلروفرم باید همیشه از موارد زیر استفاده شود:

• روپوش آزمایشگاهی
• دستکش نیتریل
• عینک ایمنی شیمیایی
• در صورت نیاز شیلد محافظ صورت

استفاده از دو لایه دستکش نیتریل توصیه می‌شود؛ زیرا فنل و کلروفرم می‌توانند از برخی انواع دستکش‌ها عبور کنند و باعث آسیب پوستی شوند.

۲. انجام کار در هود شیمیایی

تمام مراحل کار با فنل و کلروفرم باید درون هود شیمیایی استاندارد انجام شود.

فنل ماده‌ای خورنده است و می‌تواند باعث سوختگی شیمیایی پوست شود.  کلروفرم نیز برای کبد سمی است. بخارات آن می‌تواند خطرات جدی ایجاد کند و به عنوان ماده دارای احتمال سرطان‌زایی شناخته می‌شود.

به همین دلیل، تهویه مناسب محیط کار ضروری است .

۳. مزیت استفاده از سیستم‌های اتوماتیک در استخراج  DNA

با پیشرفت فناوری‌های آزمایشگاهی، سیستم‌های خودکار استخراج DNA به‌تدریج جایگاه بیشتری پیدا کرده‌اند. استفاده از تجهیزات رباتیک یا سیستم‌های بسته استخراج، می‌تواند بسیاری از مشکلات مرتبط با روش دستی فنل-کلروفرم را کاهش دهد.

سیستم‌های اتوماتیک با کاهش تماس مستقیم کاربر با مواد شیمیایی خطرناک، ایمنی فرآیند را افزایش می‌دهند. همچنین، این سیستم‌ها میزان خطای انسانی را در مراحل حساس مانند جداسازی فازها، انتقال فاز آبی و رسوب‌دهی DNA کاهش می‌دهند.

از دیگر مزایای اتوماسیون می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

• کاهش تماس با بخارات فنل و کلروفرم
• افزایش تکرارپذیری نتایج
• کاهش زمان انجام فرآیند
• امکان پردازش تعداد بیشتری نمونه به صورت همزمان

استفاده از سیستم‌های استخراج رباتیک، به‌خصوص در آزمایشگاه‌هایی با حجم کاری بالا، می‌تواند باعث افزایش ایمنی و بهره‌وری شود.

۴. ایمنی دمایی در کار با فنل

در استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم، شرایط نگهداری معرف‌ها تأثیر مستقیمی بر کیفیت استخراج DNA دارد. فنل یکی از حساس‌ترین ترکیبات مورد استفاده در این روش است و باید با دقت نگهداری شود.

فنل معمولاً باید در دمای حدود ۴ درجه سانتی‌گراد ، درون ظرف ثانویه مقاوم و دور از نور مستقیم نگهداری شود. نگهداری مناسب فنل باعث کاهش تبخیر و حفظ کیفیت آن می‌شود.

باید از منجمد کردن فنل خودداری کرد؛ زیرا تشکیل کریستال‌های فنل می‌تواند باعث تغییر خواص شیمیایی آن و حتی آسیب به ظرف نگهداری شود.

همچنین استفاده از فنل اکسیدشده یا قدیمی می‌تواند کیفیت جداسازی فازها را کاهش دهد و باعث کاهش بازده استخراج DNA شود .

۵. دفع صحیح پسماندهای شیمیایی

پسماندهای حاصل از استخراج DNA به روش فنل-کلروفرمباید مطابق قوانین ایمنی آزمایشگاه دفع شوند.

محلول‌های حاوی فنل، کلروفرم و حلال‌های آلی هالوژنه  نباید وارد فاضلاب معمولی شوند. این مواد باید در ظروف مخصوص جمع‌آوری پسماندهای حلال‌های هالوژنه قرار گیرند. همچنین، باقی‌مانده فنل باید پیش از دفع، طبق دستورالعمل‌های ایمنی سازمان مربوطه مدیریت شود. رعایت اصول دفع صحیح، علاوه بر حفاظت از کارکنان، از آلودگی محیط زیست نیز جلوگیری می‌کند .

۶. مدیریت نشت مواد شیمیایی

در صورت نشت فنل یا کلروفرم، باید اقدامات فوری و مناسب انجام شود.

برای جمع‌آوری مواد ریخته‌شده می‌توان از جاذب‌های شیمیایی مناسب مانند ورمیکولیت (Vermiculite) و پدهای مخصوص جذب مواد شیمیایی استفاده کرد. پس از جمع‌آوری ماده، سطح آلوده باید طبق دستورالعمل ایمنی آزمایشگاه پاک‌سازی شود. در صورت تماس پوستی با این مواد محل تماس باید فوراً شستشو داده شده، حادثه گزارش و اقدامات پزشکی لازم در نظر گرفته شود.  پیشگیری از تماس مستقیم با این مواد، مهم‌ترین اصل ایمنی در کار با روش فنل-کلروفرم است.

نگهداری و پایداری طولانی‌مدت مواد پس از استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم

پس از استخراج DNA، شرایط نگهداری اهمیت زیادی دارد DNA خالص‌شده در صورت نگهداری نامناسب می‌تواند دچار تخریب شود و کیفیت آن برای آزمایش‌های بعدی کاهش یابد.

عواملی مانند فعالیت نوکلئازها، چرخه‌های مکرر انجماد و ذوب، آلودگی شیمیایی و تغییرات دمایی می‌توانند پایداری DNA را تحت تأثیر قرار دهند.

نگهداری کوتاه‌مدت DNA

برای استفاده‌های فوری، DNA  حل‌شده در فاز آبی را می‌توان برای مدت کوتاه در دمای۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری کرد. این شرایط معمولاً برای نگهداری تا حدود یک هفته مناسب است. دمای پایین باعث کاهش فعالیت نوکلئازها شده و از تخریب DNA جلوگیری می‌کند. با این حال، برای نگهداری طولانی‌تر، استفاده از دماهای پایین‌تر توصیه می‌شود .

نگهداری طولانی‌مدت DNA

برای ذخیره‌سازی طولانی‌مدت،DNA  معمولاً در بافر TE نگهداری می‌شود. ترکیب معمول بافر TE ۱۰ میلی‌مولار Tris-HCl و ۱ میلی‌مولار EDTA با pH حدود ۸ است.

نمونه DNA بهتر است به چند قسمت کوچک‌تر (Aliquot) تقسیم شود تا نیاز به باز و بسته کردن مکرر یک نمونه کاهش یابد. شرایط مناسب نگهداری طولانی‌مدت منفی ۲۰ درجه سانتی‌گراد یا منفی ۸۰ درجه سانتی‌گراد است.

باید از چرخه‌های مکرر انجماد-ذوب جلوگیری شود؛ زیرا این فرآیند می‌تواند باعثشکستگی رشته DNA ، دپوریناسیون (Depurination) یا کاهش کیفیت DNA شود.

نگهداری عصاره‌های حاوی فنل

در برخی شرایط ممکن است DNA هنوز در محیط حاوی فنل قرار داشته باشد و مرحله رسوب‌دهی نهایی انجام نشده باشد. این نمونه‌ها نباید مدت طولانی نگهداری شوند. در صورت نیاز، محلول‌های حاوی فنل باید حداکثر تا ۴۸ ساعت در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری شوند.

فنل با گذشت زمان اکسید می‌شود و ترکیبات حاصل از اکسیداسیون آن می‌توانند فعالیت آنزیم‌هایی مانند DNA  polymerase  را مهار کنند. بنابراین، تأخیر طولانی در مرحله رسوب‌دهی می‌تواند کیفیت DNA نهایی را کاهش دهد .

حفاظت DNA با اتانول

برای نمونه‌هایی که نیاز به انتقال یا نگهداری طولانی‌مدت دارند، رسوب DNA را می‌توان در اتانول نگهداری کرد.

شرایط پیشنهادی اتانول ۷۰ تا ۱۰۰ درصد  و دمای منفی ۲۰ درجه سانتی‌گراد است. این روش به کاهش آسیب‌های هیدرولیتیکی کمک کرده و از رشد میکروبی جلوگیری می‌کند. نگهداری DNA به شکل رسوب اتانولی، در نمونه‌های میدانی (Field samples) و نمونه‌های ارزشمند تحقیقاتی کاربرد زیادی دارد .

کاربردهای استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم

استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم به دلیل توانایی تولید DNA با کیفیت بالا، در حوزه‌های مختلف زیست‌شناسی مولکولی و تحقیقات ژنتیکی مورد استفاده قرار می‌گیرد.

۱. استخراج DNA ژنومی

یکی از مهم‌ترین کاربردهای این روش، استخراج DNA ژنومی با کیفیت بالا است.

DNA حاصل می‌تواند در مطالعاتی از جمله موارد زیر استفاده شود.

• نقشه‌برداری برشی (Restriction Mapping)
• ساخت کتابخانه ژنی (Gene Library Construction)
• توالی‌یابی کل ژنوم (Whole Genome Sequencing)

DNA استخراج‌شده با این روش معمولاً دارای وزن مولکولی بالا است و برای تکنیک‌های حساس ژنتیکی مناسب است

۲. DNA فاقد RNA برای مطالعات اپی‌ژنتیک

یکی از مزیت‌های مهم استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم ، امکان تولید DNA با میزان بسیار پایین آلودگی RNA است. در این روش، با استفاده از آنزیم RNase A می‌توان RNA موجود در نمونه را حذف کرد و DNA خالص‌تری به دست آورد. حذف RNA در بسیاری از مطالعات مولکولی اهمیت زیادی دارد؛ زیرا حضور RNA می‌تواند در برخی آنالیزها باعث ایجاد خطا یا کاهش دقت نتایج شود.

DNA فاقد RNA برای کاربردهایی مانند موارد زیر مناسب است:

• مطالعات اپی‌ژنتیک (Epigenetic studies)
• بررسی الگوهای متیلاسیون DNA (DNA methylation analysis)
• آزمایش‌های تبدیل بی‌سولفیت (Bisulfite conversion assays)

در این روش‌ها، کیفیت و خلوص DNA اهمیت زیادی دارد؛ زیرا ترکیبات باقی‌مانده مانند RNA، پروتئین‌ها یا حلال‌های آلی می‌توانند بر واکنش‌های آنزیمی اثر منفی بگذارند. استفاده از روش فنل-کلروفرم همراه با تیمار RNase، امکان دستیابی به DNA مناسب برای مطالعات دقیق ژنتیکی و اپی‌ژنتیکی را فراهم می‌کند

۳. بازیابی DNA با وزن مولکولی بالا

یکی از ویژگی‌های برجسته روش فنل-کلروفرم، توانایی آن در استخراج DNAهای بزرگ و دست‌نخورده است.

در بسیاری از روش‌های سریع استخراج DNA، به دلیل استفاده از مراحل مکانیکی شدید یا اتصال DNA به ستون‌های کوچک، ممکن است رشته‌های DNA شکسته شوند. اما در روش فنل-کلروفرم، در صورت انجام صحیح مراحل و جلوگیری از اعمال نیروی مکانیکی زیاد، می‌توان DNA با وزن مولکولی بالا استخراج کرد.

این ویژگی باعث شده است که این روش برای نمونه‌های دشوار و ارزشمند مانند موارد زیر کاربرد داشته باشد:

• بافت‌های پزشکی قانونی (Forensic tissues)
• بقایای گیاهی قدیمی (Ancient plant residues)
• نمونه‌های باستانی (Ancient specimens)
• نمونه‌های زیستی تخریب‌شده

DNAهای بزرگ به‌دست‌آمده از این روش برای تکنیک‌هایی مانند توالی‌یابی خوانش بلند (Long-read sequencing) و مطالعات ساختار ژنوم اهمیت زیادی دارند. در این کاربردها، حفظ یکپارچگی DNA اهمیت بیشتری از سرعت استخراج دارد

۴. استخراج اسیدهای نوکلئیک ویروسی و محیطی در استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم

روش فنل-کلروفرم علاوه بر DNA ژنومی، برای استخراج اسیدهای نوکلئیک از نمونه‌های پیچیده محیطی نیز استفاده می‌شود. این روش می‌تواند DNA موجود در نمونه‌هایی مانند خاک، آب، نمونه‌های محیطی، نمونه‌های میکروبی را با خلوص مناسب استخراج کند. در نمونه‌های محیطی، ترکیبات مزاحم زیادی مانند مواد آلی طبیعی، ترکیبات هومیک ، پلی‌ساکاریدها، ترکیبات مهارکننده آنزیمی وجود دارند.

روش فنل-کلروفرم با جداسازی مؤثر پروتئین‌ها و بسیاری از ترکیبات مزاحم، امکان تولید DNA مناسب برای کاربردهایی از جمله موارد زیر را فراهم می‌کند

• مطالعات تنوع میکروبی
• توالی‌یابی متاژنومیک (Metagenomic sequencing)
• بررسی عوامل بیماری‌زا
• مطالعات اکولوژی مولکولی

مزایای روش استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم

با وجود ظهور روش‌های جدید استخراج DNA ، روش فنل-کلروفرم همچنان در بسیاری از آزمایشگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. دلیل این موضوع، ترکیبی از هزینه پایین، انعطاف‌پذیری و کیفیت بالای DNA استخراج‌شده است.

۱. هزینه مناسب

یکی از مهم‌ترین مزایای روش فنل-کلروفرم، هزینه پایین آن است. این روش به معرف‌هایی نیاز دارد که قیمت نسبتاً پایینی دارند. به‌راحتی در آزمایشگاه‌ها قابل تهیه هستند. و نیاز به کیت‌های تجاری گران‌قیمت ندارند.

در مقایسه با روش‌های مبتنی بر ستون‌های سیلیکا (Silica-based columns)  وذرات مغناطیسی (Magnetic beads) روش فنل-کلروفرم می‌تواند گزینه اقتصادی‌تری باشد. این ویژگی به‌خصوص برای آزمایشگاه‌های تحقیقاتی با بودجه محدود اهمیت زیادی دارد .

۲. بازده بالا و حفظ یکپارچگی DNA

در صورت انجام صحیح مراحل استخراج، روش فنل-کلروفرم می‌تواند مقدار زیادی DNA با کیفیت بالا تولید کند. مزیت مهم این روش، حفظ ساختار DNA با وزن مولکولی بالا است. این ویژگی باعث می‌شود DNA استخراج‌شده برای کاربردهایی مانند توالی‌یابی نسل جدید (NGS) ، توالی‌یابی خوانش بلند (Long-read sequencing)  و مطالعات ژنومی مناسب باشد. البته برای حفظ یکپارچگی DNA باید از موارد زیر جلوگیری شود:

• ورتکس شدید
• انتقال خشن نمونه
• تماس طولانی با مواد شیمیایی

زیرا این عوامل می‌توانند باعث شکسته شدن رشته‌های DNA شوند.

۳. قابلیت استفاده در حجم‌های مختلف نمونه

یکی دیگر از مزایای روش فنل-کلروفرم، قابلیت انجام آن در مقیاس‌های مختلف است.

این روش می‌تواند برای حجم‌های کم نمونه ، حجم‌های متوسط و حتی حجم‌های بالا در حد صدها میلی‌لیتر  مورد استفاده قرار گیرد. برخلاف برخی روش‌های مبتنی بر ستون، این تکنیک محدودیت جدی در ظرفیت اتصال DNA به سطح جامد ندارد. به همین دلیل، برای استخراج DNA از نمونه‌هایی که مقدار زیادی ماده زیستی دارند، انعطاف‌پذیری بیشتری ارائه می‌دهد .

معایب و محدودیت‌های روش استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم

با وجود مزایای متعدد، روش فنل-کلروفرم دارای محدودیت‌هایی نیز هست. این محدودیت‌ها باعث شده‌اند که در برخی آزمایشگاه‌ها، روش‌های جدیدتر مانند کیت‌های ستونی یا سیستم‌های مغناطیسی جایگزین شوند.

۱. خطرات شیمیایی

مهم‌ترین محدودیت این روش، استفاده از مواد شیمیایی خطرناک مانند فنل و کلروفرم است.

۲. زمان‌بر بودن و نیاز به کار دستی زیاد

روش فنل-کلروفرم شامل مراحل متعددی است، ( از جمله افزودن معرف‌ها، مخلوط کردن،  سانتریفیوژ کردن، انتقال فازها، شستشو و رسوب‌دهی ) این مراحل باعث می‌شوند فرآیند نسبت به روش‌های کیت‌محور زمان بیشتری نیاز داشته باشد. همچنین، افزایش تعداد مراحل دستی می‌تواند احتمال خطای انسانی را افزایش دهد. به همین دلیل، این روش برای آزمایشگاه‌هایی که تعداد بسیار زیادی نمونه را به صورت روزانه پردازش می‌کنند، همیشه بهترین گزینه نیست .

۳. انتقال باقی‌مانده فنل و تأثیر آن بر واکنش‌های مولکولی

یکی از مشکلات مهم در روش فنل-کلروفرم، احتمال باقی ماندن مقدار کمی فنل در فاز آبی حاوی DNA است.

اگر فنل به‌طور کامل حذف نشود، می‌تواند در بسیاری از واکنش‌های آنزیمی اختلال ایجاد کند. این ترکیب قادر است فعالیت برخی آنزیم‌های مورد استفاده در زیست‌شناسی مولکولی را کاهش دهد.

باقی‌ماندن فنل می‌تواند باعث ایجاد مشکل در آزمایش‌هایی مانند موارد زیر شود:

• واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)
• هضم DNA با آنزیم‌های محدودکننده (Restriction digestion)
• واکنش‌های کلونینگ
• برخی واکنش‌های توالی‌یابی .

نشانه‌های احتمالی انتقال فنل عبارت‌اند از:

• تغییر رنگ محلول DNA به سمت زرد یا نارنجی
• کاهش نسبت جذب A260/A230
• کاهش عملکرد DNA در آزمایش‌های پایین‌دستی

برای کاهش این مشکل، معمولاً انجام یک مرحله شستشوی اضافی با کلروفرم توصیه می‌شود. همچنین جداسازی دقیق فاز آبی و جلوگیری از برداشت لایه میانی می‌تواند میزان انتقال فنل را کاهش دهد. استفاده از تجهیزات مناسب مانند لوله‌های دارای ژل جداکننده فاز (Phase-Lock Gel Tubes) نیز می‌تواند به افزایش کیفیت جداسازی کمک کند .

۴. محدودیت در پردازش همزمان تعداد زیادی نمونه

روش فنل-کلروفرم برای آزمایشگاه‌هایی که تعداد نمونه‌های محدودی دارند، روشی مناسب و اقتصادی محسوب می‌شود. با این حال، برای آزمایشگاه‌هایی که نیاز به پردازش تعداد بسیار زیادی نمونه دارند، محدودیت‌هایی ایجاد می‌کند. دلیل این محدودیت، مراحل متعدد دستی در این روش است، از جمله:

• انتقال چندباره نمونه‌ها
• جداسازی دقیق فازها
• انجام چند مرحله سانتریفیوژ
• کنترل دستی رسوب‌دهی

در آزمایشگاه‌های با حجم کاری بالا، روش‌های جایگزین معمولاً سرعت و ایمنی بیشتری فراهم می‌کنند. برخی از این روش‌های جایگزین عبارتند از:

• سیستم‌های استخراج خودکار
• کیت‌های مبتنی بر ستون سیلیکا
• روش‌های مبتنی بر ذرات مغناطیسی

با این حال، در شرایطی که کیفیت و یکپارچگی DNA اهمیت بیشتری از سرعت دارد، روش فنل-کلروفرم همچنان یک گزینه ارزشمند محسوب می‌شود

سخن پایانی

روش استخراج DNA به روش فنل-کلروفرم یکی از روش‌های کلاسیک، قابل اعتماد و پرکاربرد در زیست‌شناسی مولکولی است. این تکنیک با استفاده از تفاوت حلالیت ترکیبات زیستی در فازهای آبی و آلی، امکان جداسازی مؤثر DNA از پروتئین‌ها و سایر ترکیبات سلولی را فراهم می‌کند.

با وجود مزایای قابل توجه، این روش محدودیت‌هایی نیز دارد. استفاده از مواد شیمیایی خطرناک مانند فنل و کلروفرم، نیاز به رعایت دقیق اصول ایمنی دارد. همچنین، مراحل متعدد دستی باعث می‌شود که این تکنیک نسبت به روش‌های جدیدتر، زمان‌برتر باشد.

در نهایت، اگرچه امروزه کیت‌های تجاری و روش‌های سریع‌تر در بسیاری از آزمایشگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند، روش فنل-کلروفرم همچنان جایگاه مهمی در استخراج DNA با کیفیت بالا دارد. این روش به دلیل هزینه مناسب، انعطاف‌پذیری و توانایی حفظ ساختار DNA، همچنان یکی از استانداردهای ارزشمند در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی محسوب می‌شود

آیا تجربه‌ای از استخراج DNA با روش فنل-کلروفرم دارید؟

اگر در آزمایشگاه با مشکلاتی مانند کاهش بازده DNA، آلودگی پروتئینی، انتقال فنل یا تخریب نمونه مواجه شده‌اید، تجربه خود را با ما به اشتراک بگذارید.

همچنین اگر به دنبال مقالات تخصصی‌تر درباره روش‌های استخراج DNA، تکنیک‌های زیست‌شناسی مولکولی و کاربردهای آزمایشگاهی آن‌ها هستید، سایر مطالب آموزشی ما را مطالعه کنید و دیدگاه‌ها و پرسش‌های خود را در بخش نظرات با ما مطرح کنید.