آزمایش‌ها و آزمایشگاهمیکروبیولوژی

آشنایی با خانواده ویبریوناسه: ویبریو کلرا عامل وبا

تهیه و تنظیم: دکتر محمد قهری

خانواده‌ی ویبریوناسه شامل چهار جنس ویبریو، آئروموناس، پلزیوموناس و فتوباکتریوم است. مهم‌ترین ویبریوهای پاتوژن نیز شامل آئروموناس، پلزیوموناس، و ویبریو می‌باشند. بیشتر این ویبریوها به‌صورت آزاد در آب زندگی می‌كنند، اما بعضی‌ها فقط  هنگام آلودگی آب با  مدفوع در آن یافت می شوند.

ویبریوها

بیش از ۶۰ گونه در این جنس وجود دارد که اکثرا کومنسال و ساپروفیت هستند و از بین آنها ویبریو کلرا (بیوتیپ کلرا و التور)، ویبریو پاراهمولیتیکوس، و ویبریو ولنیفیکوس برای انسان بیماریزا هستند. ویبریوها باکتری‌های گرم منفی خمیده (S شكل) به طول µm 2-4 هستند که در كشت كهنه پلئومورفیک بوده درحالی‌که در كشت جوان دارای انتهای گرد و نقطه‌ای و در محیط مایع به‌صورت دوتایی یا زنجیره كوتاه دیده می‌شوند (شکل ۱). آن‌ها به‌وسیله فلاژل قطبی غلافدار متحرک بوده دارای حركت سریع می‌باشند. فاقد اسپور و كپسول، هــوازی، بی‌هوازی اختیاری، شیمیوارگانوتروف و تبدیل‌کننده نیترات به نیتریت هستند، در دمای ۱۶ تا ۴۲ درجه سانتیگراد و در pH بین ۶/۸ تا ۹/۶ (در کمتر از ۶/۸ رشد نمی‌كنند و کشته می‌شوند، بنابراین به محیط اسیدی معده حساس هستند) رشد می‌نمایند. اكسیداز مثبت (به‌جز ویبریو متچنیكوویی[۱]) و كاتالاز مثبت هستند. اكثراً در غلظت كم نمک رشد خوبی دارند و عده‌ای هالوفیلیك‌اند. کربوهیدرات‌ها را بدون تولید گاز تخمیر می‌نمایند، بیشتر ویبریوها دارای آنزیم‌های خارج سلولی (آمیلاز، كتیناز، ژلاتیناز، لسیتیناز و لیپاز) هستند كه در بیماری‌زایی آنها نقش دارند. در آب‌های شور و شیرین، مدفوع انسان و حیوانات و مواد دیگر یافت می‌شوند. روی محیط‌های كشت معمولی به‌خوبی رشد می‌كنند و رشدشان در محیط مایع آب پپتونه (پس از ۹-۶ ساعت) به‌صورت یک لایه در سطح دیده می‌شود. هایبرگ بر اساس توانایی تولید اسید از گلوکز، مانوز و آرابینوز، ویبریوها را گروه‌بندی نمود. ویبریو کلرا به دلیل تولید اسید از گلوکز و مانوز و فقدان توانایی تولید اسید از آرابینوز در گروه یا دسته اول (I) هایبرگ قرار می‌گیرد.

باسیل خمیده ویبریوها در رنگ‌آمیزی گرم
شکل 1: باسیل خمیده (کاما شکل) ویبریوها در رنگ‌آمیزی گرم

ویبریو کلرا

ویبریو کلرا در اولین جداسازی به‌صورت باسیل خمیده شبیه کاما است که در کشت‌های طولانی به‌صورت باسیل‌های مستقیم مشابه باکتری‌های گرم منفی روده‌ای می‌باشند. سویه‌های ویبریو کلرا را توسط بیوتیپ و سروتیپ (بر اساس آنتی‌ژن O،ء۲۰۶ سروتیپ تقسیم‌بندی می‌شوند) شناسایی می‌کنند. ویبریو کلرا دارای ۴ بیوتیپ کلرا، التور، آلبنسیس و پروتئوس است. بیوتیپ کلرا و التور سبب وبای کلاسیک شده و سروتیپ O1 هستند. البته بعضی ویبریوهای سروتیپ O1 هم وجود دارند که توکسین کلرا را تولید نمی‌کنند و نمی‌توانند بیماری ایجاد نمایند. بیوتیپ‌های آلبنسیس و پروتئوس با آنتی‌بادی ضد آنتی‌ژن O1 آگلوتینه نمی‌شوند و معمولاً سویه‌های غیرآگلوتینه یا ویبریوی غیرکلرا نامیده می‌شوند، بنابراین ۳ گروه از سویه‌های ویبریوکلرا وجود دارد:

۱- VCO1 عامل وبا

۲- O1 نان توکسیژنیک یا آتیپیک که عامل وبا می‌شوند 

۳- NAG یا NCV که فقط گاهی سبب وبا می‌شوند، اما اغلب اسهال خونی می‌دهند

اگر سویه‌ای به‌عنوان O1 شناسایی شود، آن را بسته به فعالیت بیوشیمیایی در بیوتیپ التور یا کلرا دسته‌بندی می‌کنند. بیوتیپ کلرا با التور تفاوت‌هایی دارند که در جدول و شکل‌های زیر نشان داده شده است. لازم به ذکر است که بیوتیپ التور اغلب از افراد ناقل مزمن جدا می شود. بالاخره، هم بیوتیپ کلرا و هم التور را می‌توان با آنتی‌ژن‌های A و B و C به این صورت تیپ‌بندی کرد:

سروتیپ اوگاوا آنتی‌ژن‌های A و B، سروتیپ اینابا آنتی‌ژن‌های A و C و سروتیپ هیکوجیما آنتی‌ژن‌های A و B و C را بیان می‌کنند.

مثالی برای شناسایی کامل یک سویه به این صورت است:

ویبریو کلرا O1، بیوتیپ التور، سروتیپ اینابا.

شناسایی دقیق باکتری این امکان را به اپیدمیولوژیست‌ها می‌دهد که ظهور اپیدمی‌های جدید وبا را حدس بزنند بدین ترتیب که در صورتی که متوجه شوند چه مناطقی حاوی آب‌های آلوده است می‌توانند محل اپیدمی بعدی را در نظر گرفته و لذا اقدامات پیشگیرانه را انجام دهند.

جدول (۱): افتراق بیوتیپ کلرا از التور

ویژگی ویبریو کلرا O1
بیوتیپ کلاسیک بیوتیپ التور
اندازه ژنوم (Kb) ۳۰۰۰ ۲۵۰۰
لیز RBC گوسفند +
آگلوتیناسیون RBC جوجه +
واکنش CAMP (تغییریافته) +
حساسیت به پلی‌میکسین Bء(۵۰ واحد) و کولیستین S (+) R (-)
لیز توسط فاژ IV (کلاسیک) +
FK +
V (التور) +
تست VP +
کلنی‌های بیوتیپ التور ویبریو کلرا با همولیز β
شکل2: کلنی‌های بیوتیپ التور ویبریو کلرا با همولیز β
تست آگلوتیناسیون
شکل3: تست آگلوتیناسیون اریتروسیت‌های جوجه. این تست در بیوتیپ کلرا منفی (لوله بالا) و در بیوتیپ التور مثبت (لوله پائین) است

علائم بالینی بیماری وبا

اپیدمیولوژی بیماری وبا ارتباط نزدیکی با تشخیص چگونگی انتقال باکتری در آب و توسعه سیستم‌های بهداشتی آب دارد. بیماری وبا به‌صورت تک‌گیر، همه‌گیر و عالمگیر دیده می‌شود. دوره‌ی نهفتگی بر اساس مقاومت بدن فرد و قدرت بیماری‌زایی باکتری از ۱ تا ۵ روز است. اشکال خفیف بیماری دیده می‌شود، ولی شروع بیماری ناگهانی با تهوع و استفراغ و اسهال شدید و آبکی با حجم زیاد و تکرر فراوان است که به‌سرعت شکل مدفوعی را از دست می‌دهد و به‌صورت مایع خاکستری شبیه آب برنج درمی‌آید. حجم مایعات دفع‌شده به ۲۵ – ۱۵ لیتر در شبانه‌روز می‌رسد که حاوی سدیم، پتاسیم، و بیکربنات است (بیمار دچار اسیدوز متابولیک می‌شود). کم شدن درجه حرارت بدن، از دست دادن آب و املاح، غلیظ شدن خون و کبودی صورت، انقباض دردناک عضلات، فشارخون پایین، نبض تند و ضعیف، کاهش ادرار، دهان خشک، چشم‌های فرورفته، پوست چروکیده و شکم قایقی شکل از علائم بیماری است. کاهش آب و ادرار سبب نکروز حاد کلیه در کودکان می‌شود. دوره‌ی بیماری ۲ تا ۵ روز است. افراد به ترتیب با گروه خونی O ،B ،A و AB و همچنین سالمندان و کودکان در ابتلا به بیماری حساس‌ترند. میزان مرگ‌ومیر در افراد درمان‌نشده ۴۰% و با درمان ۱% در بزرگسالان و در اطفال ۳% است.

از سال ۱۸۱۷، ۷ پاندمی وبا در جهان گزارش شده است؛ پاندمی ۱۸۳۲ تا ۱۸۴۹ عامل مرگ ۱۵۰۰۰۰ نفر شد و پاندمی ۱۸۶۶ فقط در ایالات متحده آمریکا سبب مرگ ۵۰۰۰۰ نفر گردید. در طی ۲ سال اول دهه ۱۹۸۰ حدود ۷۹۰۰۰ نفر در ۳۴ کشور در اثر وبا از بین رفتند. بیشتر موارد وبا در قرن بیستم در هند (خصوصا در بنگال غربی) و بنگلادش که وبا در آنجا اندمیک است، رخ داده است. در سال ۲۰۱۰ به دنبال زلزله در هائیتی، وبا اپیدمی شده و باعث مرگ‌ومیر زیادی گردید.

تشخیص آزمایشگاهی:

برای جداسازی عامل وبا، فارمر (Farmer) و همکارانش یکی از روش‌های زیر را پیشنهاد نموده‌اند:

۱ – استفاده از روش‌های معمولی (بدون تلاش در بکار بردن محیط اختصاصی)

۲ – استفاده از روش‌های معمولی و جستجوی کلنی، انجام تست اکسیداز بر روی کلنی رشدنموده در پلیت

۳ – استفاده از محیط TCBS بعلاوه محیط‌های معمول در آزمایشگاه

۴ – استفاده از روش‌های اختصاصی که شانس جداسازی ویبریو کلرا،V. parahemolyticus و سایر ویبریوها را افزایش می‌دهد.

جمع‌آوری نمونه

برداشت نمونه توسط سوآب رکتال، یا ظرف تمیز و یا از شیلنگ لاستیکی فاقد مواد ضدعفونی‌کننده انجام می‌گیرد. نمونه‌های خارج روده‌ای از طریق معمول جمع‌آوری می‌گردد. نباید از لگن بیمار که حاوی مواد ضدعفونی‌کننده باکتری‌کش است، نمونه‌برداری نمود. نمونه برداشت‌شده به ظرف دربسته منتقل می‌گردد که حاوی رطوبت بوده و سریعا به آزمایشگاه فرستاده می‌شود. کشت از نمونه‌ی استفراغ بیمار در مراحل اولیه بیماری بسیار مفید است.

محیط‌های انتقالی و نگهدارنده

ویبریوها به خشکی، نور و pH اسیدی حساس بوده و به‌وسیله فلور نرمال روده از رشدشان جلوگیری می‌شود، از این رو چنانچه شرایط کشت فراهم نبود باید در محیط‌های انتقالی کشت داده شوند.

الف- باکتری در محیط نیم جامد Carry-Blair تا ۴ هفته زنده می‌ماند و از این محیط برای انتقال نمونه‌ها می‌توان استفاده کرد. از محیط انتقالی buffered glycerol saline نباید برای انتقال ویبریوها استفاده نمود.

ب- محیط انتقالی Salt Sea Water محیط نسبتا مناسبی برای انتقال باکتری است.

ج‌- اگر محیط انتقال در دسترس نبود، کاغذ (به ‌اندازه ۱/۲ × ۲ اینچ) آغشته به نمونه مدفوع آبکی را داخل پلاستیک قرار داده و سپس به آزمایشگاه انتقال داده و بر روی محیط‌های کشت عمومی و اختصاصی کشت دهید.

د- محیط کشت آب پپتونه قلیایی Alkalin peptone water) A.P.W) با pH= 8/6 که به‌عنوان محیط غنی‌کننده هم مورد استفاده قرار می‌گیرد.

آزمایش مستقیم

در مرحله حاد بیماری در مدفوع بیماران دچار اسهال دانه‌هایی شبیه برنج (مدفوع آب برنجی) مشاهـده می‌شود که در این حالت ویبریوها به شکل خالص به تعداد ۱۰۶ تا ۱۰۸ در یک میلی‌لیتر وجود دارند. با قرار دادن مقداری نمونه بین لام و لامل و مشاهده حرکت باکتری (حرکت سریع) توسط میکروسکوپ زمینه تاریک (Dark field) و فازکنتراست و در لام رنگ‌شده، باکتری‌ها به‌صورت کاما (ویرگول شکل) مشاهده می‌شوند. چنانچه از کلنی‌های محیط جامد (کشت ۲۴ ساعته) اسمیر تهیه و رنگ‌آمیزی شود، باسیل‌های مستقیم و خمیده و در محیط آبگوشتی اگر در فاز لگاریتمی باشند به شکل کوکوئید و کوکوباسیل مشاهده می‌گردد و در فاز Stationary به شکل خمیده یا کاما شکل دیده می‌شوند.

قرار دادن یک قطره آنتی‌بادی بر روی نمونه مدفوع آبکی که در آن باکتری‌ها متحرک هستند و مشاهده توقف حرکت آن‌ها دلالت بر وجود ویبریو است.

نکته مهم: در کشت‌های تازه ویبریوها خمیده یا به شکل کاما و S هستند. گاهی اوقات به شکل باسیل مستقیم دیده شده که از سایر باسیل‌های روده‌ای از نظر مورفولوژی غیرقابل افتراق می باشند.

کشت روی محیط‌های مختلف

محیط:Blood Agar

نمونه‌های مشکوک به ویبریو کلرا  در آزمایشگاه روی محیط ژلوز خوندار و مکانکی کشت داده می شوند. بعد از ۲۴ ساعت، ویبریو کلرا کلنی صاف و برجسته می‌دهد که شبه همولیز (Pseudohaemolysis) که ناشی از هضم RBC در ویبریو کلرا بیوتیپ Eltor است، مشاهده می‌گردد (ویبریوکلرا همولیز ایجاد می‌کند).

محیط نوترینت آگار (NA):

کلنی بعد از ۲۴ ساعت در Cءºء۳۷ به‌اندازه mmء۲-۱ قطر دارد و دیسک مانند و شفاف است و با تاباندن نور حالتی شبیه قوس و قزح دارد و به رنگ مایل به سبز یا آبی کمرنگ مشاهده می‌شود.

محیط مکانکی ‌آگار

همه ویبریوها بجـز V.vulnificus بر روی محیط مکانکی آگار رشد می‌کنند. کلنی این باکتری‌ها بر روی پلیت حاوی محیط مکانکی ‌آگار شبیه لاکتوز مثبت‌ها بوده و با انتروباکتریاسه اشتباه می‌شوند مگر اینکه تست اکسیداز انجام گیرد، اگرچه روی محیط مکانکی آگار ممکن است اکسیداز منفی کاذب نشان دهند. باید توجه داشت که از محیط ائوزین متیلن بلو به علت اینکه ویبریوها بر روی آن رشد نمی‌کنند، استفاده نمی‌شود.

محیط کشت تیوسولفات سیترات بایل سالت سوکروز آگار (Thiosulfate citrate bile salt sucrose agar) (TCBS):

با رشد ویبریوها روی این محیط بعد از ۴۸-۲۴ ساعت، کلنی‌ها صاف، محدب و برجسته با لبه نازک و زرد رنگ هستند که نشان‌دهنده مصرف قند لاکتوز است (که زردی آن ناشی از تخمیر قند سوکروز و ایجاد pH اسیدی و تغییر رنگ معرف بروموتیمول بلو توسط باکتری است) و در عده‌ای کلنی سبز تخم‌مرغی شکل که سوکروز منفی هستند، مشاهده می‌شود. کلنی ویبریوکلرا و ویبریو آلژینولیتیکوس به علت سوکروز مثبت بودن زرد می‌شود (شکل ۵) ویبریو میمیکوس، پاراهمولیتیکوس و ولنیفیکوس سوکروز منفی بوده و کلنی سبز می‌دهند (شکل۶). این محیط برای ایزوله کردن ویبریو کلرا از مدفوع که حاوی فلور نرمال است، استفاده می‌گردد. برخلاف سایر ویبریوها روی این محیط ویبریو هولیساه (V. hollisae) رشد نمی‌کند.

کلنی های ویبریو کلرا بر روی محیط TCBS
شکل 4- کلنی های ویبریو کلرا بر روی محیط TCBS

نکته۱: سودوموناس، پلزیوموناس و آئروموناس قابلیت رشد بر روی TCBS را داشته و کلنی آبی می‌دهند.

نکته ۲: در مناطقی که وبا به‌صورت اندمیک است، کشت مدفوع بر روی محیط انتخابی مانند TCBS و محیط‌های غنی‌کننده نظیر آب پپتونه قلیایی می‌تواند مفید باشد. با این حال، کشت‌های رایج مدفوعی بر روی محیط‌های انتخابی نظیر TCBS در نواحی غیراندمیک ضرورتی نداشته و مقرون‌به‌صرفه نیست.

نمای کلنی‌های زرد رنگ ویبریوکلرا روی محیط TCBS
شکل 5: نمای کلنی‌های زرد رنگ ویبریوکلرا روی محیط TCBS
مای کلنی‌های سبزرنگ ویبریو پاراهمولیتیکوس روی محیط TCBS
شکل 6: نمای کلنی‌های سبزرنگ ویبریو پاراهمولیتیکوس روی محیط TCBS

محیط توروکولات تلوریت ژلاتین آگار (TTGA)

بعد از ۲۴ ساعت کلنی ریز، شفاف، با مرکز سیاه‌رنگ یا خاکستری مایل به سیاه و یک هالi کدر (قهوه‌ای کم‌رنگ) در اطراف کلنی ویبریو کلرا مشاهده می‌گردد که پس از ۴۸ ساعت کلنی درشت‌تر (mmء۴-۳) با مرکز سیاه و هاله شفاف در اطراف آن دیده می‌شود. پروتئوس‌ها هم به علت تجزیه تلوریت و آزاد نمودن شبه‌فلز تلوریم کلنی سیاه ایجاد می‌نمایند، ولی چون آنزیم ژلاتیناز ندارند، هاله‌ای در اطراف کلنی ایجاد نمی‌شود، از این لحاظ از ویبریوها متمایز می‌شوند. از این محیط برای بررسی و بدست آوردن باکتری از ناقلین بخصوص ویبریو Eltor استفاده می‌گردد.

بررسی صفات بیوشیمیایی

۱- ویبریوها به‌جز ویبریو متچنیکوویی اکسیداز مثبت هستند. با انجام تست اکسیداز روی محیط مکانکی و CIN‌ ممکن است نتایج منفی کاذب حاصل شود. (همانطور که می‌دانید باکتری‌های خانواده انتروباکتریاسه اکسیداز منفی هستند، ولی آئروموناس، پلزیوموناس و سودوموناس‌ها اکسیداز مثبت هستند).

۲- محیط سیستین فاقد لاکتوز و الکترولیت (Cystine- Lactose- electerolyte- defecients): باکتری را بر روی محیط مذکور کشت داده، چنانچه ویبریوها هالوفیلیک باشند بر روی این محیط رشد نمی‌کنند، درحالی‌که ویبریوهای غیرهالوفیلیک (کلرا، التور و میمیکوس) رشد می‌کنند. این محیط دارای ۷/۵=pH و معرف آندراد (Andrade,s) است.

۳- استفاده از ماده ۱۲۹/O یا ۲ و ۴ دی آمینو ۶ و ۷ دی ایزوپروپیل پتریدین (diisopropyl pteridineء۷ وءDiamino-6ء۴و۲) که به‌صورت پودر و دیسک‌های ۱۰ و ۱۵۰ میکروگرم وجود دارد. انتروباکتریاسه و سودوموناس و آئروموناس نسبت به این ترکیب مقاومند، درحالی‌که  پلزیوموناس به غلظت ۱۰ میکروگرم و ویبریو به غلظت ۱۵۰ هم حساس است. از طرفی پلزیوموناس بر روی محیط TCBS رشد نمی‌کند، از این‌ رو از یکدیگر قابل تمایز می‌باشند.

نکته: در تمام دنیا ویبریو کلرا به O129 حساس هستند به‌جز ویبریو کلرا O1 در هند که مقاوم است.

۴- تست ایجاد رشته (String test): چنانچه کلنی مشکوک به ویبریو با ترکیب دی‌اکسی‌کولات سدیم ۰/۵% مجاور شود، تنها بیوتیپ التور ویبریو کلرا تولید رشته بلند و کشیده می‌نماید و پس از ۶۰-۴۰ ثانیه رشته مزبور قوی‌تر و چسبنده‌تر می‌شود، درحالی‌که سایر ویبریوها و از جمله پاراهمولیتیکوس تولید رشته نمی‌کنند (شکل ۶).

تست مثبت String test در بیوتیپ التور ویبریو کلرا
شکل (6): تست مثبت String test در بیوتیپ التور ویبریو کلرا

۵- محیط KIA و TSI: واکنش ویبریو کلرا بیوتیپ کلرا و التور روی TSI به‌صورت اسید/اسید (A/A) و بر روی محیط KIA به شکل آلکالین/اسید (K/A) است (محیط KIA فاقد سوکروز بوده و از این ‌رو مانند یرسینیا انتروکولیتیکا واکنش درست لاکتوز منفی را نشان می‌دهد). H2S منفی است و روی این محیط‌ها رنگ سیاه تولید نمی‌شود.

۶- لیزین دکربوکسیلاز: ویبریوکلرا، آئروموناس و پلزیوموناس لیزین مثبت‌اند.

۷- همه ویبریوها بجز متچنیکوویی نیترات مثبت‌اند.

۸- همه ویبریوها اندول (به‌جز دامسلا)، مالتوز (به‌جز هولیسه) و مانیتول (به‌جز دامسلا و هولیسه) مثبت‌اند.

۹- بعضی ویبریوها VP مثبت‌اند (جدول ۲).

نکات مهم:

• ویبریوکلرا با ایمونوفلورسانس قابل تایپینگ است.

• تست اکسیداز اولین قدم در تشخیص افتراقی و اولیه ویبریو کلرا است.

• از تست نواری API 20E می‌توان در تشخیص ویبریو کلرا استفاده کرد.

• امروزه از تست ایمنوکروماتوگرافی برای جداسازی سریع O1 و O139 از نمونه‌های مدفوعی استفاده می‌گردد.

• هیچ‌کدام از سیستم‌های تشخیصی تجاری موجود برای شناسایی گونه‌های ویبریو قابل استناد نیستند و تنها زمانی باید استفاده شوند که دقت آن‌ها مورد تأیید باشد. استفاده از تکنیک MALDI-TOF و روش‌های مولکولی در زمانی که شناسایی کامل نیاز باشد مفیدتر است.

واژه‌نامه:

Vibrio metschnikovii [۱]

منبع مورد استفاده:

  • دکتر رضا میرنژاد. مروری تازه بر یرسینیا، کامپیلوباکتر، و هلیکوباکتر. ماهنامه اخبار ازمایشگاهی. شماره ۱۸۶٫ سال ۱۳۹۸

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا