رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو : اصول، روش ها و نتایج

تکنیک رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو (Papanicolaou stain) برای تمایز سلول‌ها در اسمیر ترشحات مختلف بدن استفاده می‌شود. این تکنیک با نام رنگ آمیزی پاپ نیز شناخته می‌شود. رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو یک تکنیک بافت‌شناسی چند رنگی است که توسط جورج پاپانیکولائو، پدر آسیب شناسی سلولی توسعه یافته است.

در ادامه قصد داریم به بررسی کاربردهای این تکنیک رنگ‌آمیزی و نتایج حاصل از آن بپردازیم.

آشنایی با تکنیک رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو

همانطور که در بخش مقدمه گفته شد، رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو یک تکنیک بافت‌شناسی است. رنگ‌آمیزی پاپ یک تکنیک بسیار قابل اعتماد است که برای غربالگری سرطان دهانه رحم در زنان بسیار کاربرد دارد.

این تکنیک را می‌توان روی اسمیر زنان (پاپ اسمیر)، خلط، ادرار، مایع مغزی نخاعی، مایع شکمی، مایع جنب، مایع سینوویال، مایع منی، مواد آسپیراسیون شده با سوزن ظریف، نمونه‌های تومور، یا سایر ترشحات حاوی سلول انجام داد.

شکل کلاسیک رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو شامل پنج رنگ در سه محلول به شرح زیر است.

• هماتوکسیلین: رنگ آمیزی هسته با استفاده از محلول‌‌ هماتوکسیلین انجام می‌شود.
• ضد لکه OG-6: رنگ نارنجی جی (OG-6) برای رنگ آمیزی کراتین استفاده می‌شود. نقش اصلی آن، رنگ آمیزی سلول‌های کوچک کارسینوم سلول سنگفرشی کراتینه کننده موجود در خلط است.
• رنگ Eosin Azure که متشکل از سه محلول زیر است:

• ائوزین Y که سلول‌های سنگفرشی سطحی اپیتلیال، هسته، مژک‌ها و گلبول‌های قرمز خون را رنگ می‌کند.
• سبز روشن SF مایل به زرد که سیتوپلاسم تمام سلول‌های دیگر را رنگ می‌کند. این رنگ در حال حاضر بسیار گران است و بدست آوردن آن دشوار است. بنابراین برخی آزمایشگاه‌ها بجای آن از Fast Green FCF استفاده ی‌کنند. اما سبز روشن SF نتایج بصری متفاوتی را ایجاد می‌‌کند و توسط برخی رضایت بخش تلقی نمی‌شود.
• قهوه‌ای بیسمارک Y هیچ رنگی ندارد و در فرمولاسیون‌های امروزی اغلب حذف می‌شود.

ضد لکه‌ها (counterstains ) از رنگ‌آمیزی بیش از حد سلول‌ها جلوگیری می‌کنند. رنگ آمیزی بیش از حد می‌تواند جزئیات هسته و خطوط سلولی را مبهم کند. به‌ویژه در مواردی که سلول‌ها روی لام همپوشانی دارند.

اسید فسفوتنگستیک برای تنظیم pH ضد لکه ها اضافه می‌شود و به بهینه سازی شدت رنگ کمک می‌کند.

مراحل رنگ آمیزی

پیش از رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو ، لازم است اسمیر تثبیت شود. این کار باید به روش استاندارد صورت گیرد. به عنوان مثال  با استفاده از الکل ۹۵ درصد یا متانول ۱۰۰ درصد.

رنگ پاپ هنوز به طور کامل استاندارد نشده است و در فرمول‌های مختلفی وجود دارد. تکنیک‌های  رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو در رنگ‌های مورد استفاده، نسبت آ‌ن‌ها و زمان انجام فرآیند متفاوت هستند. در ادامه به بررسی یکی از رایج‌ترین روش‌های رنگ آمیزی رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو خواهیم پرداخت.

مراحل رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو

مراحل رنگ آمیزی پاپانیکولائو بخ شرح زیر است:

• لام را جهت تثبیت به مدت ۱۵ دقیقه در اتانول ۹۵ درصد قرار دهید. سپس آن را آبکشی کنید.
• لام را به مدت ۱ الی ۳ دقیقه در محلول هماتوکسلین قرار دهید. سپس آن را آبکشی کنید.
• از آنجایی که محلول‌های هماتوکسلین متفاوتی وجود دارند، زمان رنگ آمیزی نیز بین ۱ الی ۳ دفقیقه متغیر است.
• لام را حدود ۱۰ مرتبه در اتانول ۹۵ درصد فروبرده و از جار خارج نمایید. (حرکت dip)
• سپس آن را به مدت ۱ دقیقه و نیم درون رنگ OG-6 قرار دهید.
• لام را حدود ۱۰ مرتبه در اتانول ۹۵ درصد فروبرده و از جار خارج نمایید. (حرکت dip)
• لام را با محلول EA-50 یا Modified EA-50 یا EA-65 به مدت ۲٫۵ دقیقه رنگ کنید.
• حدود ۲ مرتبه در اتانول ۱۰% درصد فروبرده و از جار خارج نمایید. (حرکت dip) . سپس آن را به مدت ۱ دقیقه درون اتانول ۱۰۰% قرار دهید.
• در نهایت لام را در ۲ تغییر زایلن، هرکدام ۲ دقیقه قرار دهید.

نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو

نتایج حاصل از تکنیک رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو برای نمونه‌هایی که خوب آماده و رنگ آمیزی شده باشند به شرح زیر است:

•  هسته های سلولی به رنگ آبی تا سیاه هستند.
• سلول‌های با محتوای بالا کراتین زرد هستند.
• گلیکوژن نیز زرد رنگ می‌شود.
• سلول‌های سطحی نارنجی تا صورتی و سلول‌های میانی سبز فیروزه‌ای تا آبی هستند.
• سلول‌های متاپلاستیک اغلب به صورت هم‌زمان سبز و صورتی رنگ می‌شوند.

سخن پایانی

تکنیک رنگ‌آمیزی پاپانیکولائو (Papanicolaou stain) برای تمایز سلول‌ها در اسمیر ترشحات مختلف بدن استفاده می‌شود و کاربرد زیادی در بافت شناسی دارد. البته این تکنیک ممکم است در آزمایشگاه‌های مختلف با استفاده از روش‌های مختلفی انجام شود.

شما درآزمایشگاه خود چگونه از این روش رنگ‌آمیزی استفاده می‌کنید؟