تست تولید سولفید هیدروژن (H2S)
اسید آمینه‌های حاوی گوگرد در ساختمان برخی پروتئین‌ها وجود دارد. برخی از گونه‌های باکتریایی، این گوگردِ موجود در اسیدهای آمینه یا سایر ترکیبات را به‌شکل سولفید هیدروژن آزاد می‌کنند. از این توانایی باکتری‌ها می‌توان به عنوان یک مشخصه مهم برای شناسایی آن‌ها استفاده کرد. به منظور تشخیص این‌گونه باکتری‌ها از آزمایشی به نام تست تولید سولفید هیدروژن (H2S) استفاده می‌شود. در ادامه‌ی این مطلب قصد داریم به معرفی این آزمایش بپردازیم.
مروری بر تست تولید سولفید هیدروژن
برای آزمایش تولید گاز سولفید هیدروژن، یک ترکیب آهن و یک ترکیب گوگرد در محیط کشت گنجانده می‌شود. اگر ترکیب گوگرد توسط سویه باکتری کاهش یابد، سولفید هیدروژن تولید خواهد شد. گونه‌های باکتریایی که قادر به تولید سولفید هیدروژن هستند، به کمک اثر آنزیمی خود و ازطریق کاهش اسیدهای آمینه حاوی گوگرد مانند سیستین، متیونین (یا از طریق احیای ترکیبات گوگرد معدنی مانند تیوسولفات‌ها در طی تجزیه پروتئین)، منجر به تولید گاز هیدروژن سولفید می‌شوند. این گاز با ترکیب آهن موجود در محیط آزمایش، واکنش داده و رسوب سیاه رنگِ سولفید آهن را تشکیل می‌دهد. در واقع می‌توان گفت که رنگ سیاه به عنوان یک شاخص برای حضور سولفید هیدروژن عمل می‌کند.
محیط کشت‌های مورد استفاده برای تست تولید سولفید هیدروژن
جهت انجام تست تولید سولفید هیدروژن، می‌توان از محیط کشت‌های مختلفی استفاده کرد. اما درجه حساسیت این محیط کشت‌ها ممکن است با یکدیگر تفاوت‌هایی داشته باشد. به‌عنوان مثال، استات سرب، حساس‌ترین شاخص موجود در محیط کشت‌هایی است که برای تست تولید سولفید هیدروژن به کار می‌روند و لازم است تنها برای بررسی باکتری‌هایی که مقادیر کمی H2S تولید می‌کنند، مورد استفاده قرار گیرد.
به همین دلیل میکروبیولوژیست‌ها جهت انجام این تست باید ابتدا نیازهای خود و ویژگی‌های نمونه‌ی آزمایشی را بسنجند. در میکروبیولوژی تشخیصی، لوله‌های حاوی محیط کشت [۱] SIM [2]، KIA یا [۳] TSI معمولاً برای تشخیص تولید هیدروژن سولفید استفاده می‌شوند. در بین این سه محیط کشت بیوشیمیایی، TSI کمترین حساسیت را دارد. اعتقاد بر این است که ساکارز موجود در این محیط کشت، تولید سولفید هیدروژن را سرکوب می‌کند.
با این وجود، نتیجه استفاده از تمامی این محیط کشت‌ها، در صورتی که تولید هیدروژن سولفید مثبت باشد، یک چیز خواهد بود. یک رسوب سیاه رنگ در محیط یا روی نوار کاغذ صافی! این رسوب سیاه رنگ، بیشتر در امتداد خط تلقیح، در اعماق محیط‌های اسلنت کالچر، یا در مراکز کلنی‌های در حال رشد روی آگار دیده می‌شود.
جدول ۱ محیط کشت‌های رایج برای تست تولید سولفید هیدروژن را نشان می‌دهد.
جدول ۱. محیط کشت های رایج برای بررسی تولید سولفید هیدروژن
|
محیط کشت |
منبع سولفور |
نشانگر H2S |
| سولفیت بیسموت | پپتون+سولفیت | سولفات آهن |
| سیترات سولفید آگار | سدیم تیوسولفات | آمونیوم فریک سیترات |
| دی اکسی کولات سیترات آگار (DCA) | پپتون | سیترات فریک |
| لیزین آیرون آگار (LIA) | سدیم تیوسولفات | آمونیوم فریک سیترات |
| آهن آگار کلیگلر (KIA) | سدیم تیوسولفات | سولفات آهن |
| آگار تریپل شوگر آیرون (TSI). | سدیم تیوسولفات | سولفات آهن |
| آگار استات سرب | سدیم تیوسولفات | استات سرب |
| سالمونلا-شیگلا (SS) آگار | سدیم تیوسولفات | سیترات فریک |
| سولفید، گاز ایندول، حرکت (SIM) | سدیم تیوسولفات | آهن پپتونیزه شده |
| محیط آگار گزیلوز-لیزین-دئوکسی کولات (XLD) | سدیم تیوسولفات | آمونیوم فریک سیترات |
| هکتون انتریک آگار | سدیم تیوسولفات | آمونیوم فریک سیترات |
مراحل انجام تست تولید سولفید هیدروژن
آزمایش تولید هیدروژن سولفید را می‌توان هم در لوله‌های حاوی محیط کشت و هم در پلیت حاوی آگار انجام داد. در ادامه به بررسی مراحل انجام این تست خواهیم پرداخت.
لوله آزمایش حاوی محیط کشت
- محیط کشت را در محل انجام آزمایش قرار دهید تا به دمای محیط برسد. درصورتی که روی محیط کشت یا لوله‌آزمایش ترک مشاهده کردید، از آن استفاده نکنید.
- با استفاده از یک لوپ استریل، یک کلنی که به خوبی ایزوله شده است را از کشت نمونه جدا کنید.
- لوپ را تقریبا تا انتهای لوله آزمایش، درون محیط کشت فرو ببرید.
- برای ارگانیسم‌های فستی دیوس (fastidious) یک نوار کاغذ آغشته به استات سرب را در بالای لوله آزمایش قرار دهید و سپس درب لوله را ببندید.
- درب لوله را بیش از حد محکم نکنید تا گاز در لوله آزاد شود.
- لوله را در دمای ۳۵ تا ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت انکوباسیون کنید.
- در صورت تمایل، می‌توانید زمان انکوباسیون را کمی طولانی‌تر کنید. زیرا ممکن است برخی از ارگانیسم‌ها برای واکنش به زمان بیشتری نیاز داشته باشند. به طور مثال کامپیلوباکترها ممکن است برای تولید H2S به ۳ روز انکوباسیون نیاز داشته باشند.
مراحل انجام تست تولید سولفید هیدروژن در پلیت حاوی آگار نیز به صورتی است که در بالا ذکر شد. به این منظور کافی است کلنی را روی آگار به روش کشت خطی (streak plate) تلقیح کنید.
بررسی و تفسیر نتایج آزمایش تولید سولفید هیدروژن
نتایج حاصل از انجام تست سولفید هیدروژن در جدول ۲ نشان داده شده است.
جدول ۲. نتایج تست تولید سولفید هیدروژن
| محیط آزمایش | واکنش‌های مثبت | واکنش‌های منفی |
| تولید H2S در لوله | رنگ سیاه در سراسر محیط یا یک یک حلقه سیاه در بالای محیط کشت | عدم سیاه شدن محیط کشت |
| تولید H2S در پلیت | کلنی‌های سیاه رنگ احاطه شده توسط ناحیه قهوه‌ای رنگ با جلای فلزی | فاقد کلنی‌های سیاه |
| کاغذ استات سرب | رنگ قهوه‌ای مایل به سیاه نوار کاغذی | عدم تغییر رنگ نوار کاغذی |
آزمایش سولفید هیدروژن محیط کشت SIM
آزمایش سولفید هیدروژن سالمونلا
آزمایش سولفید هیدروژن با استفاده از کاغذ سرب استات
کدام ارگانیسم‌ها H2S مثبت هستند؟
جدول ۳ برخی از میکروارگانیسم‌هایی که قادر به تولید هیدروژن سولیفید یا در اصطلاح H2S مثبت هستند را نشان می‌دهد.
جدول ۳.برخی میکروارگانیسم‌های H2S مثبت
| نام فارسی | نام انگلیسی |
| سیتروباکتر فروندی | Citrobacter freundii |
| گونه های سالمونلا | Salmonella species |
| پروتئوس | Proteus mirabilis |
| پروتئوس ولگاریس | Proteus vulgaris |
| ادواردزیلا تاردا | Edwardsiella tarda |
جمع‌بندی
همانطور که گفته شد، برخی باکتری‌ها به کمک اثر آنزیمی خود قادر به تولید گاز سولفید هیدروژن هستند. به همین دلیل یکی از آزمایشاتی که میکروبیولوژیست‌ها برای تشخیص باکتری‌ها انجام می‌دهند، تست تولید سولفید هیدروژن است که در محیط کشت‌های مختلفی انجام می‌شود. در این آزمایش چنانچه ارگانیسم H2S مثبت باشد، رسوب سیاه رنگی روی محیط آزمایش نمایان خواهد شد. البته شدت بروز این رسوب بسته به حساسیت محیط کشت و میزان تولید سولفید هیدروژن متفاوت است. در این مطلب سعی کردیم مروری بر مراحل تست تولید سولفید هیدروژن و محیط کشت‌های مناسب انجام این آزمایش داشته باشیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.
واژه نامه:
| Triple sugar iron (TSI) agar | [۳] | Kligler iron agar (KIA) | [۲] | Sulfide-indole-motility (SIM) Medium | [۱] |
