رنگ آمیزی آکریدین اورنج : اصول، روش و نتایج

رنگ آمیزی آکریدین اورنج (Acridine orange) یک تکنیک رنگ‌آمیزی فلورسنت است. این تکنیک با نام آکریدین  نارنجی نیز شناخته می‌شود. در این روش رنگ‌آمیزی، رنگ به اسید نوکلئیک (اعم از DNA یا RNA) موجود در موجودات زنده متصل می‌شود. به این ترتیب طی پدیده‌ی فلورسانس رنگ‌های مختلفی منتشر می‌شوند که به تمایز اندامک‌های سلولی کمک می‌کند.

در این مقاله قصد داریم به بررسی این روش رنگ‌آمیزی، اصول و نتایج آن بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

مروری بر تکنیک رنگ آمیزی آکریدین اورنج

آکریدین اورنج یک رنگ فلورسنت است که به صورت انتخابی عمل می‌کند و به اسید نوکلئیک سلول نفوذ می‌کند. اتصال این رنگ به اسید نوکلئیک ناشی از برهم‌کنش‌های الکترواستاتیکی مولکول‌های آکریدین و جفت‌های اسید نوکلئیک-باز است.

• این رنگ در صورت اتصال به dsDNA (در ۵۲۰) فلورسانس سبز منتشر می‌کند.
• اما اگر به ssDNA یا RNA (در ۶۵۰ نانومتر) متصل شود، فلورسانس قرمز منتشر می‌کند.
• آکریدین اورنج از نوع کاتیونی است. به همین دلیل می‌تواند وارد محفظه‌های اسیدی مانند لیزوزوم‌ها نیز شود. در شرایط در pH پایین، نور نارنجی ساطع می‌کند.

آکریدین اورنج (AO) معمولاً در آنالیز فلوسیتومتری فیزیولوژی سلولی و بررسی میکروسکوپی فلورسنت میکروارگانیسم‌ها استفاده می‌شود.

کاربرد تکنیک رنگ آمیزی آکریدین نارنجی

یکی از کاربردهای مهم تکنیک رنگ آمیزی آکریدین اورنج تایید وجود باکتری در کشت خون مثبت است. در شرایطی که نتیجه کشت خون مثبت باشد و تفسیر نتایج رنگ آمیزی گرم دشوار باشد،  از روش آکریدین نارنجی برای تایید تشخیص استفاده می‌شود. تحقیقات نشان داده است که تکنیک رنگ آمیزی آکریدین اورنج، روشی حساس، سریع و قابل اعتماد برای شناسایی باکتری‌ها در کشت خون در مراحل اولیه انکوباسیون است. این تکنیک حتی در نمونه‌هایی با مقدار ارگانیسم کم، بهتر از تکنیک رنگ آمیزی گرم پاسخ می‌دهد.

در ادامه به بررسی سایر کاربردهای این تکنیک رنگ‌آمیزی خواهیم پرداخت:

• شمارش بار میکروبی در نمونه: آکریدین نارنجی به نوکلئیک اسید باکتری‌های زنده و مرده متصل می‌شود. به همین دلیل برای شمارش بار میکروبی در نمونه کاربرد دارد.

• تشخیص باکتری های فاقد دیواره سلولی (به عنوان مثال، مایکوپلاسما) رشد یافته در کشت: مشاهده باکتری‌های فاقد دیواره سلولی در رنگ آمیزی گرم سخت است زیرا نمی‌توانند رنگ‌های گرم را حفظ کنند.

• رنگ آمیزی افتراقی سلول‌های انسانی و سلول‌های پروکاریوتی با میکروسکوپ فلورسانس: سلول‌های انسان به رنگ سیاه تا سبز، رنگ می‌شوند که در آن ارگانیسم‌های نارنجی روشن به راحتی قابل تشخیص هستند.

• غربالگری مالاریا: آکریدین اورنج یک ابزار غربالگری سریع برای تشخیص مالاریا است که در روشی به نام پوشش کمی بافی (QBC) استفاده می‌شود.

• آنالیز میتوکندری و محتوای لیزوزومی توسط فلوسایتومتری

• تشخیص بصری اسیدهای نوکلئیک روی ژل‌های آگارز و پلی آکریل آمید

• شناسایی سلول‌های آپوپتوز (سلول‌های مرده)

مراحل رنگ آمیزی

تکنیک رنگ آمیزی آکریدین اورنج بسته به کاربرد آن‌ متفاوت است. در ادامه به بررسی این روش‌ها خواهیم پرداخت.

الف/ رنگ آمیزی نمونه‌های بالینی با آکریدین نارنجی در pH پایین (رنگ‌آمیزی اسیدی آکریدین نارنجی)

• مواد مورد نیاز: رنگ آکریدین نارنجی ، اسید استیک گلسیال و آب مقطر
• تهیه معرف: ۵۰ میلی گرم رنگ آکریدین نارنجی در ۱۰ میلی لیتر آب مقطر حل کنید تا محلول استوک تهیه شود. این محلول را در یخچال نگهداری کنید.
• روش رنگ آمیزی
• یک اسمیر روی لام میکروسکوپ تمیز آماده کنید.
• اجازه دهید اسمیر در هوا خشک شود.
• سپس لام را با متانول تثبیت کرده و مجددا اجازه دهید تا خشک شود.
• لام را درون محلول آکریدین اورنج ۰۱ درصد قرار دهید. برای این کار لازم است استوک را با آب مقط مخلوط کنید تا محلول رنگ‌آمیزی آماده شود.
• پس از گذشت ۲ دقیقه، لام‌ها به آرامی با آب شسته شده و خشک کنید.
• در نهایت می‌توانید اسمیر را زیر میکروسکوپ فلورسنت بررسی کنید.

لازم به ذکر است که در صورت مثبت بودن نتیجه، باکتری‌ها، رنگ نارنجی ایجاد می‌کنند. در حالیکه سلول‌ها و بقایای سلولی،  به شکل پس زمینه‌ای سبز تا زرد مشخص می‌شود.

ب/ رنگ آمیزی آکریدین اورنج برای تجزیه و تحلیل توسط فلوسیتومتری

• مواد مورد نیاز
• اسید سیتریک ۱ مولار (۱٫۹۲ گرم در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر)
• دی بازیک فسفات سدیم ۲ مولار (۲٫۸۳۹ گرم در هر ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر)
• Triton X-100 (بیکر)
• EDTA (5 مولار)
• سدیم کلرید (NaCl)
• پودر آکریدین نارنجی
• ساکارز

• تهیه معرف

برای تهیه معرف‌های لازم است در تجزیه و تحلیل توسط فلوسیتومتری دو استوک آماده می‌شود.

الف/ آماده سازی استوک ۱

۴۰ میکرولیتر  EDTA

۲۶٫۴۸ میلی لیتر اسید سیتریک

۶٫۸۵ میلی لیتر دی بازیک فسفات سدیم

۱۳٫۶۹ گرم ساکارز

۰٫۲ میلی لیتر Triton X-100

تمامی مواد را در ۱۲۵ میلی لیتر آب مقطر حل کنید. محلول را با استفاده از کاغذمخصوص،  فیلتر کنید. این استوک را در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری نمایید.

ب/ آماده سازی استوک ۲

۹٫۹۲ میلی لیتر اسید سیتریک

۵٫۴۶ میلی لیتر دی بیسیک فسفات سدیم

۱٫۷ گرم NaCl

تمامی مواد را در ۱۵۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل کنید. محلول را با استفاده از کاغذمخصوص،  فیلتر کنید. این استوک را در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری نمایید.

• روش رنگ آمیزی

۲ میلی‌گرم از پودر آکریدین اورنج را در ۱ میلی‌لیتر آب مقطر حل کنید.

این محلول را به کمک استوک ۲ و به نسبت  ۱:۱۰۰ رقیق کنید.

 ۰٫۵میلی لیتر  از محلول فوق را روی نمونه بریزید.

۰٫۵ میلی لیتر از استوک ۱ را در دمای اتاق روی نمونه بریزید.

در صورت مثبت بودن نتیجه، دو حالت دیده می‌شود:

• اگر رنگ آکریدین اورنج به dsDNA متصل شده باشد، فلورسانس سبز دیده می‌شود.
• اگر رنگ آکریدین اورنج به ssDNA یا  RNAمتصل شده باشد، فلورسانس قرمز دیده می‌شود.

محدودیت رنگ آکریدین اورنج چیست؟

رنگ آکریدین نارنجی غیر اختصاصی است. به این معنی که تمام سلول‌های حاوی اسید نوکلئیک را رنگ می‌کند، بنابراین بین باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت تفاوتی قائل نمی‌شود.

توضیحات تکمیلی

پیش از انجام مراحل رنگ‌میزی، محلول رنگ آمیزی، حتما محلول آکریدین اورنج را از نظر رنگ و شفافیت بررسی کنید. محلول باید شفاف، نارنجی و بدون رسوب باشد.

در هر بار استفاده، یک لام آماده شده از باکتری‌های شناخته شده مانند اشریشیا کلی مخلوط شده با استافیلوکوک را رنگ آمیزی کنید و نتایج مورد نظر را بررسی کنید. این کار به عنوان کترل کیفیت نتایج انجام می‌شود. در این حالت:

• باکتری‌های گرم منفی و کوکسی‌های گرم مثبت فلورسنت (نارنجی) هستند.
• پس زمینه غیر فلورسنت (سبز-زرد) است.