آزمایش‌ها و آزمایشگاهمیکروبیولوژی

اصول، روش و نتایج کشت خطی

کشت دادن باکتری‌‌ها در آزمایشگاه یکی از مهم‌ترین فعالیت‌هایی است که برای شناسایی یک ارگانیسم و تشخیص بیماری‌ها استفاده می‌شود. چنانچه نمونه‌ای روی یک محیط کشت، کشت داده شود، ممکن است حاوی انواع مختلفی از ارگانیسم‌ها باشد. همچنین این احتمال وجود دارد که محقق به دنبال سویه‌ی خاصی از یک باکتری در نمونه باشد. برای دست‌یابی به چنین اهدافی به رقت نمونه نیاز است. اما چطور می‌توان به این هدف دست یافت؟

تکنیک کشت خطی یا streak plate روشی است که به منظور جداسازی یک سویه خاص از باکتری مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این مقاله قصد داریم تا به بررسی تکنیک کشت خطی بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

اصول کشت خطی

اصول کشت خطی
شکل ۱. اصول کشت خطی

در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی، یک کشت میکروبی را می‌توان به دو دسته تقسیم کرد.

الف) کشت مخلوط

ب) کشت خالص

کشت مخلوط حاوی دو یا چند گونه از میکروارگانیسم‌ها است در حالی که یک کشت خالص فقط شامل یک گونه است.

طی شناسایی یک میکروارگانیسم، اولین و مهم‌ترین مرحله جداسازی گونه‌های منفرد (خالص) از یک نمونه مخلوط است. این کار اغلب به کمک تکنیک کشت خطی انجام می‌شود.

در این روش ابتدا یک لوپ استریل به یک کشت باکتری آغشته می‌شود. سپس لوپ روی سطح یک آگار جامد خط زده شده و یک سری رگه‌های موازی که باهم همپوشانی ندارند ایجاد می‌کند. همانطور که کشت روی آگار جامد، رقیق می‌شود، تعداد ارگانیسم در قسمتهای دیگر کاهش می‌یابد. در نهایت برخی از سلول‌های باکتریایی منفرد از یکدیگر جدا می‌شوند و ازهم فاصله می‌گیرند. سپس می‌توان این تک کلنی‌ها را روی پلیت‌های دیگری قرار داد و به صورت جداگانه بررسی نمود.

برای انجام تکنیک کشت خطی روش‌های مختلفی وجود دارد که پرکاربردترین ‌آن‌ها عبارتند از:

  • T streak
  • روش چهار مرحله‌ای (Quadrant Streak Pattern )
  • رادیانت استریک (Radiant Streak)
  • کانتینیوس استریک (Continuous Streak)

به ‌طور کلی استفاده از این روش‌ها تفاوت چندانی نداشته و به منبع تلقیح، ترجیح و مهارت میکروبیولوژیست بستگی دارد. به طور مثال از روش چهار مرحله‌ای (quadrant streak pattern ) اغلب برای نمونه‌های مشکوک به تراکم سلول بالا استفاده می‌شود.

مواد و لوازم مورد نیاز برای کشت خطی

تجهیزات مورد نیاز برای کشت خطی
شکل ۲. تجهیزات مورد نیاز برای کشت خطی

برای انجام کشت خطی اغلب به تجهیزات زیر نیاز است:

  • محیط کشت مخلوط
  • لوپ فلزی
  • چراغ بونزن
  • پلیت آگار (آگار مغذی یا هر ماده دیگر)
گیف تبلیغاتی انکوباتورهای pit

روش انجام تکنیک کشت خطی

همانطور که گفته شد، تکنیک کشت خطی ممکن است بر اساس ترجیح و مهارت میکروبیولوژیست به روش‌های مختلفی انجام شود. در ادامه به بررسی نحوه انجام کشت خطی خواهیم پرداخت.

۱. روش T streak

کشت خطی T streak
کشت خطی T streak
کشت خطی T streak
کشت خطی T streak
کشت خطی T streak
کشت خطی T streak
کشت خطی T streak

 

۱. در این روش صفحه آگار به سه قسمت تقسیم می‌شود.

 

 

۲. لوپ فلزی را روی قسمت آبی رنگ شعله نگه دارید تا داغ شود. اجازه دهید لوپ خنک شود.

 

 

۳. در حالی‌که لوپ را در دست دارید، با دست دیگر درب لوله حاوی محیط کشت را باز کنید. از درب برای محافظت از آگار در برابر آلودگی هوا استفاده کنید.

 

 

۴. لوپ را به آرامی روی سطح آگار و به صورت زیگزاگ بکشید. مراقب باشید سطح آگار بریده نشود.

 

 

۵. مجددا لوپ را گرم کنید تا استریل شود.

 

 

 

۶. پتری دیش  را ۹۰ درجه بچرخانید و لوپ را از ناحیه‌ای که تازه روی آن خط کشیده‌اید به شکل “زیگ زاگ” حرکت دهید، بدون اینکه مجددا قسمت‌های قبلی را لمس کنید.

 

 

۷. مرحله ۵ و ۶ را دوباره تکرار کنید تا زمانی که ناحیه باقیمانده پتری دیش، با خطوط زیگ زاگ پر شود. به این ترتیب، هر بار تعداد باکتری‌های کمتری جمع می‌شود تا در نهایت سلول‌های باکتریایی منفردی برای ایجاد تک کلنی جدا شوند.

۸. درب پتری دیش را ببندید.

پس از گذشت مدت زمان لازم، بخش اول حاوی بیشترین تعداد باکتری، بخش دوم به نسبت کمتر و بخش آخر حاوی کمترین میزان تجمع باکتریایی و تعدادی تک کلنی خواهد بود.

۲. کشت خطی ۴ مرحله‌ای

کشت خطی 4 مرحله‌ای
کشت خطی 4 مرحله‌ای
کشت خطی 4 مرحله‌ای
کشت خطی 4 مرحله‌ای
کشت خطی 4 مرحله‌ای
کشت خطی 4 مرحله‌ای
کشت خطی 4 مرحله‌ای

 

۱. لوپ فلزی را روی قسمت آبی رنگ شعله نگه دارید تا داغ شود. اجازه دهید لوپ خنک شود.

۲. لوله حاوی محیط کشت را روی میز بگذارید و درب آن را کمی بلند کنید. از درب به عنوان محافظ در برابر آلودگی هوا استفاده نمایید.

 

 

۳. لوپ آغشته به محیط کشت را روی سطح آگار قرار دهید. با شروع از لبه پلیت، لوپ را به آرامی روی سطح آگار بکشید. مراقب باشید سطح آگار بریده نشود.

 

 

۴. لوپ را برداشته و درب پلیت را بگذارید. مجددا لوپ را حرارت دهید تا استریل شود. حرارت دادن کامل لوپ بسیار مهم است زیرا روی حلقه لوپ باکتری‌های زیادی وجود دارد.

 

 

۵. پلیت را  کمی بچرخانید. (کمتر از ۹۰ درجه). اجازه دهید لوپ خنک شود. می‌توانید لوپ را به قسمتی از آگار که باکتری در آن وجود ندارد تماس دهید تا خنک گردد. یک الگوی زیگ زاگی دیگر را از انتهای الگوی اول شروع کنید.

 

 

۶. لوپ را استریل کنید و سپس کشت خطی را در قسمت سوم انجام دهید. این کار باید از انتهای کشت خطی قسمت دوم آغاز شود.

 

 

۷. مجددا لوپ را به کمک حرارت استریل کنید. سپس کشت خطی برای قسمت چهارم را از انتهای قسمت سوم شروع کرده و تا وسط پلیت ادامه دهید. مراقب باشید که خطوط قبلی را لمس نکنید.

در نهایت لوپ را حرارت دهید و پلیت را لیبل‌گذاری کنید. پلیت را با توجه به دستورالعمل‌های تعیین شده و به صورت برعکس درون انکوباتور قرار دهید.

کشت خطی به روش Radiant Streak
شکل ۳. روش Radiant Streak

۳.  رادیانت استریک (Radiant Streak)

۱. با استفاده از لوپ استریل شده، کشت باکتریایی را در ناحیه کوچک نزدیک لبه پلیت قرار دهید (منطقه ۱)

۲. لوپ را حرارت دهید و ۵ ثانیه صبر کنید تا خنک شود.

۳. از لبه منطقه ۱، به کمک لوپ ردیف‌های مستقیمی ایجاد کنید.

۴. لوپ را مجددا حرارت دهید و اجازه دهید خنک شود. سپس از روی آخرین خطوط افقی، خطوطی روی رگه‌های ایجاد شده بکشید. (مطابق شکل ۳)

کشت خطی به روش کانتینیوس استریک (Continuous Streak)
شکل ۴. روش continuous streak

۴. کانتینیوس استریک (Continuous Streak)

۱. لوپ را به کمک حرارت استریل کرده و آن‌را به کشت باکتریایی آغشته کنید.

۲. مطابق با شکل ۴، با شروع از لبه پلیت (منطقه A) ارگانیسم‌ها را در یک حرکت مداوم به سمت مرکز پلیت گسترش دهید. دقت داشته باشید که فشار بیش از حد وارد نکرده و آگار را جدا نکنید.

۳. پلیت را ۱۸۰ درجه بچرخانید.

۴. بدون حرارت دادن لوپ، کشت خطی را از ناحیه B (سمت مخالف) شروع کرده و به سمت مرکز پلیت پیش بروید.

۶ نکته مهم که باید در انجام کشت خطی در نظر داشت

نکات کشت خطی
شکل ۵. نکات کشت خطی

میکروبیولوژیست‌ها ممکن است در طول یک روز کاری، بارها از روش کشت خطی برای جداسازی کلنی ها استفاده کنند. اما استفاده از روش نادرست می‌تواند منجر به بروز خطا و ایجاد آلودگی شود. به همین دلیل در این قسمت از مطلب، قصد داریم نکاتی را بیان کنیم که رعایت آن‌ها می‌تواند از بروز چنین مشکلاتی جلوگیری کند.

۱. اول لیبل‌گذاری کنید، سپس کشت خطی را آغاز نمایید

لیبل‌گذاری واضح روی پلیت برای شناسایی میکروارگانیسم تنها چند ثانیه طول می‌کشد اما از بروز مشکلات بعدی پیشگیری خواهد کرد.

۲. سطح آگار را خشک نگه دارید

اطمینان حاصل کنید که پلیت آگار فاقد قطرات رطوبت متراکم هستند. در صورت وجود رطوبت، پلیت را یک شب در دمای اتاق بگذارید یا آن‌ها را درون هود لامینار قرار دهید تا خشک شود.

۳.  کشت خطی را خیلی از لبه آغاز نکنید

  تماس با لبه پلیت می‌تواند منجر به انتقال آلودگی‌ها به آگار شود. به همین دلیل هنگام کشت خطی، از لمس لبه پلیت با لوپ خودداری کنید.

۴.  کمی باکتری کافی است

دقت داشته باشید که برای انجام کشت خطی، مقدار کمی تلقیح لازم است. اگر از نمونه‌ی تلقیح شده روی یک پلیت دیگر استفاده می‌کنید، تک کلنی‌های جدا شده را بردارید و درصورتی که از سوسپانسیون استفاده می‌کنید، تنها ۵ الی ۱۰ میکرولیتر از سوسپانسیون کافی است.

۵. استریل کردن لوپ را فراموش نکنید

برای گسترش تلقیح همیشه از تجهیزات استریل استفاده کنید. بعد از انجام کشت خطی در هر قسمت، لوپ را حرارت دهید. استفاده از لوپ استریل به شما این امکان را می‌دهد که مایع تلقیح شده را روی پلیت رقیق کرده و با پخش لایه‌های نازک‌تر و یکنواخت‌تر ، کلنی‌های جدا شده به‌دست آورید.

۶. مراقب نفس‌های خود باشید

پلیت‌های بدون درب را در فاصله ایمن از صورت خود قرار دهید. نفس کشیدن روی پلیت‌ها یک اشتباه واضح است و تقریبا تمامی میکروب شناسان برای اجتناب از این کار آموزش دیده‌اند. با این وجود این مشکل هنوز هم یکی از  دلایل شایع آلودگی در آزمایشگاه‌ها محسوب می‌شود.

جمع‌بندی

همانطور که گفته شد تکنیک کشت خطی یکی از روش‌های بسیار کاربردی در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی است که به روش‌های مختلفی انجام می‌شود و برای جداسازی باکتری‌های خاص از یک نمونه حاوی مخلوطی از میکروارگانیسم‌های مختلف استفاده می‌شود.

این روش برای رشد باکتری‌ها در محیط کشت استفاده می‌شود تا میکروبیولوژیست با استفاده از آن بتواندباکتری‌های منفرد را جدا و نمونه‌برداری کنند.

در این مطلب سعی کردیم تا مروری بر روش کشت خطی و انواع رایج آن داشته باشیم.

خوشحال می‌شویم نظرات و تجربیات خود را در رابطه با این تکنیک با ما و دیگر خوانندگان این مطلب به اشتراک بگذارید.

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا