بهبود تکرارپذیری در کشت سلول

اگر شما نیز در یک آزمایشگاه علوم زیستی یا کالیبراسیون مشغول به کار هستید، حتما می‌دانید که هیچ چیز برای یک محقق نا امیدکننده‌تر از این نیست که ۲ آزمایش مشابه را انجام دهند و نتایج کاملا متفاوتی را مشاهده کنند و به اصطلاح آزمایشات او فاقد قابلیت تکرارپذیری باشند. یا اینکه ۲ کاربر مختلف آزمایش یکسانی را انجام دهند اما اختلاف چشم‌گیری در داده‌ها مشاهده شود. گاهی اوقات هم پیش می‌آید که داده‌های به دست آمده در آزمایشگاه قابل تکرار هستند، اما چنانچه آزمایش در آزمایشگاه دیگری انجام شود، نتایج قابل تکرار نخواهند بود و نمی‌توان به این نتایج اعتماد کرد.

این موضوع را می‌توان کابوسی در آزمایشگاه‌ها، علی‌الخصوص آزمایشگاه‌های کالیبراسیون تجهیزات و کشت سلول محسوب کرد.

طی چند سال اخیر، این موضوع به یک بحث در میان محققین تبدیل شده است که با نام بحران قابلیت بازتولید (reproducibility crisis) شناخته می‌شود.

به طور کلی، پرسنل آزمایشگاهی نیاز دارند تا یک آزمایش را بر اساس دستورالعمل خاص و مشخصی بارها انجام دهند، بدون اینکه در داده‌ها اختلاف فاحشی دیده شود (یعنی داده‌ها قابلیت بازتولید داشته باشند).

اما بر اساس یک نظرسنجی که در سال ۲۰۱۶ در مجله Nature منتشر شد، محققین آزمایشگاه‌های علوم زیستی با مشکلات زیادی برای بازتولید (Reproduce) آزمایشات مواجه هستند.

این امر ممکن است به دلایل مختلفی از جمله تفاوت در الزامات مربوط به استانداردهای کیفی یک آزمایشگاه، مهارت کاربران مختلف، شرایط محیطی یک آزمایشگاه و … رخ دهد.

به همین دلیل برای افزایش قابلیت بازتولیدپذیری در آزمایشگاه‌ها، پروتکل‌هایی تعیین شده است. به کارگیری این پروتکل‌ها به کاربران کمک می‌کند تا به داده‌هایی قابل مقایسه و تکرارپذیر دست یابند. به این ترتیب فرایند آزمایش حتی در صورت تغییر کاربر و یا محیط آزمایشگاه، قابل تکرار خواهد بود و اختلاف فاحشی در نتایج مشاهده نخواهد شد.

آزمایشگاه‌های کشت سلول یکی از محیط‌هایی هستند که بازتولیدپذیری در آن‌ها اهمیت بسیاری دارد. به همین دلیل در این مطلب سعی داریم تا به موضوع بازتولیدپذیری در آزمایشگاه‌های کشت سلول بپردازیم. پس اگر به دنبال راهنمایی برای افزایش بازتولیدپذیری در آزمایشگاه کشت سلول خود هستید، در ادامه با ما همراه باشید.

۱- شناسایی کشت (Identification)

اولین نکته‌ای که برای افزایش بازتولید داده‌های مربوط به کشت سلول باید بخاطر داشت، شناسایی دقیق سلول است. به همین دلیل لازم است تا برای هر رده سلولی خاص یک سند آماده شود که اطلاعات مهم مربوط به هویت سلولی در آن ثبت شده است.

این سند باید حاوی اطلاعات زیر باشد:

• بافت مبدا، تاریخ دریافت و ذکر نام اصلی رده سلول
• شماره الحاق یا accession number (درصورتی که رده سلول از یک بانک سلول بدست آمده باشد)
• لات نامبر (lot number)
• یک نام منحصر به فرد جهت جلوگیری از ابهام در رابطه با سایر رده‌های سلولی (در صورت استفاده از یک رده سلولی جدید حین آزمایش)
• اطلاعات مربوط به مورفولوژی^[۱] سلول

چگونه مورفولوژی سلول را مشخص کنیم؟

منشأ رده سلولی با ارائه اطلاعاتی که در سند بالا ذکر شده است، مشخص می‌گردد. اما برای شناسایی بیشتر سلول و ارزیابی آسان‌تر آن، لازم است تا تصاویر میکروسکوپی از رده سلولی کشت شده در تراکم‌های سلولی مختلف تهیه گردید. این تصاویر امکان بررسی ویژگی‌های اساسی موروفولوژی سلول را در یک نگاه فراهم می‌کنند.

مورفولوژی یک رده سلولی معمولاً به بافت منشا آن سلول باز می‌گردد.

به طور مثال، رده‌های سلولی گرفته شده از خون، تمایل دارند به صورت سوسپانسیون^[۲] رشد کنند و مورفولوژی آن‌ها شبیه لنفوبلاست^[۳] است.

در مقابل، ممکن است مورفولوژی رده‌های سلولی چسبنده (Adherent cell lines) که از بافت‌های جامد به دست آمده‌اند، به صورت اپیتلیال^[۴]، اندوتلیال^[۵]، نورون یا فیبروبلاست^[۶] باشد.

دقت داشته باشید که مشاهده مورفولوژی سلولی نباید تنها روشی باشد که برای شناسایی سلول‌ها انتخاب می‌شود. بلکه انجام سایر آزمایشات نیز برای اطمینان از هویت رده سلول و دستیابی به داده‌های قابل اعتماد، بسیار اهمیت دارد.

۲- مراحل کشت سلول (Cultivation)

تفاوت‌های کوچک در روش انجام آزمایش، می‌تواند باعث تغییرات چشمگیری در نتایج شود. به همین دلیل مرحله‌ی بعدی که می‌تواند در بازتولیدپذیری داده‌های به دست آمده از کشت سلول موثر باشد، ثبت خلاصه‌ای از مراحل کشت است. این امر به ایجاد نتایجی قابل اطمینان که مستقل از کاربر هستند، کمک خواهد کرد.

 برای تهیه خلاصه‌ای از روند کشت سلول به موارد زیر توجه داشته باشید:

• برای انجام هر آزمایش از یک پروتکل استاندارد استفاده کنید.
• هرگونه تغییر را یادداشت کرده و به گونه‌ای ثبت و مستندسازی کنید که کاربرانِ دیگر نیز قادر به استفاده از آن باشند.
• هنگام تغییر پارامترهایی مانند زمان یا غلظت، تغییرات را به‌طور دقیق ثبت کنید. به این ترتیب می‌توانید پیش‌بینی کنید که تغییر این پارامترها، چگونه بر نتایج تأثیر می‌گذارند.
• شرایط کشت سلول، باید متناسب با نوع سلول انتخاب گردد.
• ترکیبات محیط کشت شامل همه مواد تشکیل دهنده مانند محیط پایه^[۷]، سرم و مکمل‌ها^[۸]، مواد افزودنی لازم برای رشد یا تمایز سلول و … باید با ذکر جزئیات ثبت شوند.
• ممکن است برخی از رده‌های سلولی به سطح رشد یا ماتریس^[۹] خاصی نیاز داشته باشند، که باید به طور مداوم در هنگام کشت استفاده شود. ثبت دقیق این موارد برای دست یابی به داده‌های قابل اطمینان ضروری است.
• شرایط محیط کرایو پریزرویشن (cryopreserved) و تراکم مناسب ذوب سلول (appropriate thawing density) نیز باید به طور دقیق ثبت گردد.

۳- بررسی روزانه کشت سلول

نکته‌ی بعدی برای دست‌یابی به نتایج تکرارپذیر در کشت سلول و امکان بازتولید نتایج، بررسی روزانه‌ی کشت است. کاربران با بررسی تغییراتی که در رده سلولی صورت می‌گیرد و جمع‌آوری داده‌های به دست آمده، می‌توانند به اطلاعات مفیدی دست پیدا کنند. اما سوال اینجاست که چگونه می‌توان مطمئن بود تغییرات صورت گرفته در کشت سلول، در نتیجه‌ی رشد سلول‌های مورد نظر است و ناشی از عدم تعادل در سیستم کشت نیست؟

پاسخ این سوال، بررسی روزانه کشت و آماده‌سازی یک منحنی رشد است. منحنی رشد، اطلاعاتی راجع به رفتار کشت فراهم می‌کند و بنابراین ارزیابی اینکه آیا تغییرات کشت ناشی از عدم تعادل در سیستم کشت سلولی است یا خیر، راحت‌تر صورت خواهد گرفت.

یک منحنی رشد در برگیرنده چه اطلاعاتی است؟

همان‌طور که در شکل ۲ نیز می‌توان مشاهده کرد، منحنی رشد حاوی اطلاعات زیر است:

• فاز رشد تاخیری (Lag phase): سلول‌ها به سطح متصل شده و شروع به پخش شدن می‌کنند.
• فاز رشد لگاریتمی (Log phase): سلول‌ها با سرعت مشخصی رشد می‌کنند و زمان ۲ برابر شدن سلول (doubling time) مشخص می‌شود.
• فاز رشد ثابت (Plateau phase): رشد سلول کند و یا حتی متوقف می‌شود.
• فاز مرگ (Death phase): سلول‌ها شروع به مردن کرده و از سطح جدا می‌شوند.

۴- اطمینان از زنده ماندن سلول

زنده بودن سلول، یکی از مواردی است که همواره باید مورد ارزیابی قرار گیرد. انجام آزمایشاتی مانند رنگ آمیزی و یا استفاده از آنالایزر می‌تواند در این امر موثر باشد.

علاوه‌بر این، توصیه می‌شود تعداد سلول‌های زنده در میلی‌لیتر و همچنین درصد زنده ماندن را ثبت کنید. به طور کلی می‌توان گفت که در یک کشت سلول سالم، نرخ زنده ماندن (viability rate) سلول‌ها بین %۹۵-%۸۰ است و چنانچه این میزان از %۸۰ کمتر باشد، برای آزمایش‌های بعدی نباید از این کشت استفاده نمود و لازم است تا یک کشت جدید جایگزین گردد.

جمع‌بندی

با مطالعه مطالب گفته شده می‌توان دریافت که بازتولیدپذیری به معنای شفاف و واضح بودن هر اقدام مرتبط با یک آزمایش است. این امر به ویژه در آزمایشگاه‌های کشت سلول اهمیت زیادی دارد.

برای رسیدن به این هدف، باید همواره نکاتی را به خاطر داشت تا با بکارگیری آن‌ها بازتولیدپذیری نتایج را افزایش داد. در این مطلب سعی کردیم ۴ مورد از نکات مهمی که می‌تواند در افزایش بازتولیدپذیری نتایج در یک آزمایشگاه کشت سلول مفید باشد را بیان کنیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.

همچنین، از آنجایی که نیاز است اطلاعات مربوط به کشت سلول به طور مناسب یادداشت شود، تا به این ترتیب کاربران دیگر نیز قادر به انجام آزمایشات باشند، فایل زیر برای آسان شدن فرایند ثبت اطلاعات آماده شده است.

واژه‌نامه: