تکنیک رنگ‌آمیزی سودان بلک
همانطور که می‌دانید رنگ‌آمیزی یکی از تکنیک‌های مهم و پایه‌ای برای تشخیص میکروارگانیسم‌ها و تشخیص بیماری‌ها و اختلالات گوناگون است. میکروارگانیسم‌های مختلف در ساختار خود اجزایی دارند که با رنگ‌آمیزی آن‌ها می‌توان نوع میکروارگانیسم‌را شناسایی کرد. به طور مثال در سیتوپلاسم برخی از باکتری‌ها قطرات چربی وجود دارد که میل ترکیب با رنگ‌های محلول در چربی را دارند. رنگ‌های خانواده سودان (Sudan) در آزمایشگاه‌های هیستوپاتولوژی جهت شناسایی اینگونه باکتری‌ها و بررسی و مشاهده لیپیدها مورد استفاده قرار می‌گیرند.
در این مطلب قصد داریم مروری بر تکنیک رنگ‌آمیزی سودان بلک B (Sudan Black B) که یکی از اجزای خانوده سودان است داشته و مراحل انجام این تکنیک رنگ‌آمیزی را بیان کنیم. پس در ادامه با همراه باشید.
مروری بر سودان بلک B و کاربرد آن
همانطور که در قسمت مقدمه نیز گفته شد، رنگ‌های خانواده سودان برای رنگ آمیزی چربیها در ساختار میکروارگانیسم‌ها و همچنین قطرات چربی در بافت کاربرد گسترده‌ای دارند. سودان II، سودان III، سودان IV، روغن قرمز O و سودان بلک B از اعضای این خانواده هستند. رنگ‌های خانواده سودان از نظر ساختاری، جزء رنگ‌های دیازو هستند، یعنی رنگ‌هایی که به طور تجاری در رنگ آمیزی منسوجات، پوشاک و پلاستیک استفاده می‌شوند. با این وجود، در آزمایشگاه‌ها برای رنگ‌آمیزی نمونه‌های بیولوژیکی و چربیها و لیپیدها نیز کاربرد گسترده‌ای دارند. در این بین، سودان بلک B کاربرد گسترده‌تری داشته و برای بررسی لیپیدها در بافت توصیه می‌شود.
سودان بلک B برای اولین بار در سال ۱۹۳۴ توسط شخصی به نام L. Lison معرفی شد.
این عضو از خانواده سودان غیر فلورسنت و نسبتاً حرارتی (relatively thermostable) است که برای رنگ‌آمیزی تریگلیسیریدها و لیپیدهای خنثی در نمونه بافت فریز شده و برخی لیپوپروتئین‌ها استفاده می‌شود. سودان بلک B با ترکیبات اسیدی در لیپیدها ترکیب شده و فسفولیپیدها، لیپوپروتئین‌ها و تری گلیسیریدهای موجود در نمونه را رنگ آمیزی می‌کند.
سایر رنگ‌های سودان اغلب مخصوص لیپیدها هستند. اما سودان بلک B مانند سایر رنگ‌های سودان نیست و می‌توان از آن برای رنگ آمیزی کروموزوم‌ها ، دستگاه گلژی و گرانول‌های لکوسیت نیز استفاده کرد.
از ویژگی‌های سودان بلک B می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:
- مشخصات ظاهری: پودر قهوه‌ای رنگ متمایل به سیاه
- حداکثر جذب در ۵۹۶ الی ۶۰۵ نانومتر
- نقطه ذوب ۱۲۰الی۱۲۴ درجه سانتی‌گراد
برخی از ارگانیسم‌هایی که با استفاده از رنگ‌آمیزی سودان سیاه B قابل شناسایی هستند، عبارتند از:
- باسیلوس سرئوس (Bacillus cereus)
- باسیلوس مایکوئیدس (Bacillus mycoides)
- ازتوباکتر بیجراينکي (Azotobacter beijerinckii)
- ریزوبیوم leguminosarum
- مایکوباکتریوم آویوم (Mycobacterium avium)
- مایکوباکتریوم لپرا (Mycobacterium leprae)
- قارچ (fungi)
مواد و محلول‌های مورد استفاده در تکنیک رنگ‌آمیزی سودان بلک B
در ادامه مواد ومحلول‌های مورد استفاده در رنگ‌آمیزی سودان بلک B را ذکر خواهیم کرد.
۱. فیکساتیو:
بافر فرمالین خنثی ۱۰%
۲. بافت:
برش پارافین ۵ میکرومتری یا برش فریز ۸ میکرومتری
۳. محلول سودان بلک B :
سودان بلک B ، (C.I. 26150) …………………..ء۱٫۰ گرم
ایزوپروپیل الکل …………………………………………. ۷۰٫۰ میلی‌لیتر
پودر سودان بلک B را با ایزوپروپیل الکل ترکیب کرده و به مدت ۳۰ دقیقه روی هات پلیت قرار دهید. ۰٫۳ گرم دکسترین را در ۳۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل کرده و به ترکیب سودان بلک اضافه کنید. افزودن دکسترین به سودان سیاه B به تثبیت محلول و در نتیجه افزایش ماندگاری آن (شش ماه یا بیشتر) کمک می‌کند. محلول را به مدت ۵ دقیقه مخلوط کرده و سپس از کاغذ فیلتر عبور دهید. محلول را قبل از استفاده مجددا فیلتر کنید.
۴. محلول نوکلئار فست رد:
۰٫۱ گرم نوکلئار فست رد را به کمک گرما در ۱۰۰ میلی‌لیتر محلول سولفات آلومینیوم ٪۵ حل کنید. اجازه دهید محلول خنک شود و سپس آن را فیلتر کنید. در نهایت چند دانه تیمول به عنوان ماده نگهدارنده اضافه کنید.
۵. ژل گلیسیرین:
ژلاتین ………………….. ۱۰٫۰ گرم
آب مقطر …………….. ۶۰٫۰ میلی‌لیتر
مواد را با استفاده از هات پلیت حرارت دهید تا ژلاتین حل شود.
سپس مواد زیر را به ترکیب بالا اضافه کنید.
گلیسرین ……………….. ۷۰٫۰ میلی‌لیتر
فنل ذوب شده ……………….. ۱٫۰ میلی‌لیتر
مراحل رنگ‌آمیزی با استفاده از سودان بلک B
برای رنگ‌آمیزی بافت مورد نظر خود با استفاده از تکنیک سودان بلک B مراحل زیر را طی کنید. اگر از بافت های فریز شده استفاده می‌کنید، رنگ‌آمیزی را از مرحله ۳ آغاز نمایید.
۱. مراحل پارافین‌زدایی را انجام دهید و بافت را با استفاده از الکل ۷۰٪ هیدراته کنید.
۲. لام را درون جای لام شیار دار قرار دهید و اجازه دهید خشک شود.
۳. لام را به مدت ۱ الی ۳ ساعت درون محلول سودان بلک B قرار دهید.
۴. اگر از بافت های فریز شده استفاده می‌کنید، لام را به مدت ۲۰ دقیقه در دمای اتاق درون سودان بلک B قرار دهید.
۵. لام را دو مرتبه با ایزوپروپیل الکل ۷۰٪ بشویید.
۶. لام را ۶ مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.
۷. لام را به مدت ۳ دقیقه درون محلول نوکلئار فست رد قرار دهید.
۸. پس از گذشت ۳ دقیقه، لام را ۲ مرتبه با آب مقطر آبکشی کنید.
۹. لام را با استفاده از ژل گلیسیرین تثبیت کنید.
برخی از رنگ‌های سودان سرطان‌زا و سمی هستند. بنابراین هنگام انجام تکنیک رنگ آمیزی سودان از تجهیزات حفاظت فردی مناسب استفاده کنید.
نتایج رنگ‌آمیزی به روش سودان بلک B
فسفولیپیدها ………………… آبی مایل به سیاه یا سیاه
چربیها …………………………. آبی مایل به سیاه یا سیاه
گلبول‌های قرمز …………… سرمه‌ای
هسته ………………………… صورتی
جمع‌بندی
همانطور که گفته شد رنگ‌های خانواده سودان دسته‌ای از رنگ‌های دی‌آزو هستند که نه تنها در صنایع منسوجات بلکه در آزمایشگاه‌های هیستوپاتولوژی نیز کاربرد گستره‌ای دارند. سودان بلک B یکی از اعضای این رنگ‌ها است که برای بررسی چربی انباشته شده در بافت و یا شناسایی و تشخیص ارگانیسم‌هایی که در ساختار خود چربی دارند، استفاده می‌شود. لیپیدها و فسفولیپیدها در رنگ‌آمیزی سودان بلک به رنگ آبی متمایل به سیاه مشاهده می‌شوند. اما توجه داشته باشید که نتایج رنگ‌آمیزی حاصل از رنگ‌های سودان همیشه یکسان نیست. به عنوان مثال در رنگ‌آمیزی روغن قرمز O، که یکی از اعضای رنگ‌های سودان است، لیپیدها به رنگ قرمز مشاهده می‌شوند.
در این مطلب سعی کردیم مروری بر رنگ‌آمیزی به روش سودان بلک B داشته باشیم. امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.
