۷ نکته برای آزمایش الایزای موفقیت آمیز

احتمالا نام آنتی بادی به گوشتان آشنا است. آنتی بادی‌ها پروتئین‌هایی هستند که بدن شما در پاسخ به موادی مضر، به نام آنتی ژن‌، تولید می‌کند. پزشکان و محققین با شناسایی این آنتی‌بادی‌ها در بدن می‌توانند متوجه شوند که یک فرد به چه عفونتی مبتلا است.

تست الایزا (ELISA) آزمایشی است که آنتی بادی‌ها را در خون شما شناسایی و اندازه گیری می‌کند. در این مقاله قصد داریم تا ابتدا مروری اجمالی بر این تکنیک داشته باشیم و سپس ۷ مورد از نکات مهم برای داشتن یک آزمایش الایزای موفق را بیان کنیم. پس اگر برای افزایش اطلاعات خود به دنبال آشنایی بیشتر با این تکنیک هستید و یا اگر در آزمایشگاه کار می‌کنید و قصد دارید آزمایش الایزای موفقی داشته باشید، در ادامه با ما همراه باشید.

آزمایش الیزا چیست؟

پیش از هر چیز اجازه دهید ابتدا مروری کلی بر تست الایزا و هدف انجام آن داشته باشیم. آزمون الایزا که با نام‌های ELISA یا EIA نیز شناخته می‌شود، نوعی ایمنواسی (immunoassay) است که معمولاً برای تعیین کمیت سطح یک ماده خاص در یک نمونه استفاده می‌شود. نمونه‌هایی که به‌طور معمول در الایزا استفاده می‌شوند، شامل سرم، پلاسما، سوپرناتانت کشت سلول ^[۱]، لیزات سلولی^[۲]، بزاق، محلول‌های بافتی و ادرار هستند.

تست الایزا اغلب به عنوان ابزاری برای غربالگری استفاده می‌شود. برای تشخیص موارد زیر می‌توان از آزمایش ELISA استفاده کرد:

• HIV
• بیماری لایم (Lyme disease)
• کم‌خونی پرنیشیوز (pernicious anemia)
• تب منقوط کوه‌های راکی (Rocky Mountain spotted fever)
• روتاویروس (rotavirus)
• سرطان سلول سنگفرشی (squamous cell carcinoma)
• سیفلیس (syphilis)
• توکسوپلاسموز (toxoplasmosis)
• ویروس واریسلا-زوستر (varicella-zoster virus)، که باعث آبله مرغان و زونا می‌شود
• ویروس زیکا (Zika virus)

اگر یک فرد علائمی از بیماری‌های فوق را داشته باشد، ممکن است پزشک آزمایش الایزا را تجویز نماید. البته برای تشخیص نهایی، آزمایش الایزا کافی نبوده و انجام یکسری آزمایش‌های تکمیلی نیز ضروری خواهد بود.

اصول اولیه تست الایزا

آزمایش الایزا یکی از ساده‌ترین آزمایش‌هایی است که می‌توان آن را به طور همزمان روی چندین نمونه انجام داد. تست ELISA به طور معمول در یک پلیت چند حفره‌ای (۹۶ یا ۳۸۴ حفره) انجام می‌شود و برای انجام آن ابتدا لازم است تا آنتی‌بادی (یا آنتی‌ژن) در یک بستر جامد ثابت شوند (immobilize). برای درک بهتر اصول الایزا، فرض کنید در این مثال آنتی‌ژن درون پلیت ثابت شده است. ثابت کردن آنتی‌‌ژن‌ها در یک بستر جامد، جداسازی آنتی بادی یا آنتی‌ژن را از بقیه اجزای موجود در نمونه تسهیل می‌کند.

سپس نمونه‌ درون حفره ریخته خواهد شد. در صورتی که نمونه حاوی آنتی بادی باشد، این آنتی بادی‌ها به آنتی ژن متصل می‌شوند. یعنی کمپلکس‌های آنتی ژن-آنتی بادی ایجاد می‌شود. برای شناسایی کمپلکس‌های آنتی ژن-آنتی بادی، یک آنتی بادی ثانویه به حفره پلیت اضافه خواهد شد. این آنتی بادی‌ ثانویه، که به یک آنزیم متصل شده است، به آنتی بادی موجود در نمونه می‌چسبد. سپس پلیت در انکوباتور قرار گرفته و پس از آن شسته خواهد شد. شستن پلیت به این دلیل انجام می‌شود تا آنتی بادی‌های ثانویه اضافی (متصل نشده)  شسته شوند تا در نتایج اختلالی ایجاد نگردد.

 در مرحله بعد، یک سوبسترا (Substrate) به این محیط اضافه می‌شود. سوبسترا ماده‌ای است که تحت تاثیر آنزیم تغییر می‌کند. با افزودن این ماده به محیط، آنزیم با آن واکنش داده و یک محصول رنگی تولید می‌شود .در نهایت به کمک یک آنالایز، شدت و تراکم رنگ بررسی شده و میزان آنتی‌بادی موجود در نمونه مورد ارزیابی قرار خواهد گرفت.

انواع تکنیک الایزا

تست الایزا چهار نوع اصلی دارد که هرکدام مزایا ، معایب و کاربرد خاصی دارند. این ۴ تکنیک عبارتند از:

• الایزا مستقیم (Direct ELISA)
• الایزا غیرمستقیم (Indirect ELISA)
• الایزا ساندویچ (Sandwich ELISA)
• الایزا رقابتی (Competitive ELISA)

در ادامه به طور مختصر مروری بر هریک از این تکنیک‌ها خواهیم داشت. توجه داشته باشید که حین انجام آزمایش الایزا هم می‌توان آنتی‌ژن و هم آنتی‌بادی را در پلیت ثابت کرد. در تکنیک‌های زیر اغلب آنتی‌ژن ثابت شده است.

۱. الایزا مستقیم

در روش الایزا مستقیم، یک آنتی ژن مستقیماً در حفره پلیت ثابت شده و یک آنتی بادی نشان‌دار شده (کونژوگه) به آن اضافه می‌شود. سپس سوبسترا اضافه شده و سیگنالی متناسب با مقدار آنالیت موجود در نمونه تولید می‌کند. در الایزا مستقیم تنها یک آنتی بادی استفاده می‌شود.

کاربرد:

• ارزیابی ویژگی‌های آنتی بادی
• بررسی فعل و انفعالات مهاری

۲. الایزا غیر مستقیم

در تکنیک الایزا غیر مستقیم، مشابه با الایزا مستقیم، یک آنتی ژن در پلیت ثابت می‌شود. اما این تکنیک نسبت به الایزا مستقیم یک مرحله بیشتر دارد. در الایزا غیر مستقیم ابتدا یک آنتی بادی اولیه (کونژوگه نشده)  به پلیت اضافه شده و به آنتی ژن متصل می‌شود. سپس یک آنتی بادی ثانویه کونژوگه اضافه شده و به آنتی‌بادی اولیه متصل می‌شود. در نهایت سوبسترا اضافه شده و سیگنالی متناسب با مقدار آنتی ژن متصل در چاهک (حفره پلیت) تولید می‌کند.

کاربرد:

اندازه گیری آنتی بادی‌های اندوژنوس (endogenous) یا درون زاد.

۳. الایزا ساندویچ

تکنیک ساندویچ رایج‌ترین نوع الایزا است. در این تکنیک، آنتی ژن بین دو آنتی بادی خاص قرار می‌گیرد. این دو آنتی بادی معمولاً جفت آنتی بادی همسان نامیده می‌شوند. این جفت آنتی‌بادی به پلیت اضافه می‌شوند. سپس نمونه حاوی آنتی ژن اضافه شده و آنتی‌ژن به آنتی بادی‌ها متصل می‌شود. لازم به ذکر است که در این روش آنتی‌ژن باید دارای دو ناحیه آنتی‌ژنیک متفاوت باشد تا به هر دو آنتی بادی متصل گردد. سپس آنتی بادی تشخیصی کونژوگه اضافه خواهد شد که به پروتئین هدف متصل می‌شود (از طریق اپی‌توپ epitope). در نهایت سوبسترا اضافه شده و سیگنالی متناسب با مقدار آنالیت موجود در نمونه تولید می‌کند.

کاربرد:

• تعیین غلظت آنالیت در یک نمونه بیولوژیکی

۴. الایزا رقابتی

از الایزا رقابتی برای مولکول‌های کوچک استفاده می‌شود. در این تکنیک ابتدا آنتی‌ژن در حفره پلیت ثابت می‌شود. سپس نمونه‌ی حاوی همان آنتی‌ژن به همراه آنتی‌بادی اولیه انکوباسیون می‌شود. سپس این نمونه به چاهکی که آنتی‌ژن در آن ثابت شده اضافه می‌گردد. در ادامه آنتی بادی ثانویه کونژوگه شده (که مختص اتصال به آنتی بادی اولیه است) اضافه شده و با افزودن سوبسترا نتایج بررسی خواهد شد.

هرچه آنتی ژن موجود در نمونه بیشتر باشد، آنتی‌بادی‌های اولیه بیشتری به آن‌ها متصل شده و در نتیجه آنتی بادی‌های کمتری به آنتی‌ژ‌ن ثابت شده در چاهک متصل می‌شوند. در نتیجه آنتی ژن مرجع کمتری شناسایی شده و سیگنال ضعیف شده و کاهش می‌یابد.

کاربرد:

• تعیین غلظت مولکول‌های کوچک.

۷ نکته برای آزمایش ELISA موفقیت آمیز

تا به اینجای مطلب سعی کردیم شما را تا حدودی با تست الایزا و تکنیک‌های انجام آن آشنا کنیم. در ادامه قصد داریم به مرور نکاتی بپردازیم که رعایت آن‌ها می‌تواند به شما در داشتن یک آزمایش الایزا موفق کمک کند.

۱.  قبل از شروع آزمایش ، درک کاملی از آن داشته باشید

پیش از انجام تست الایزا باید به این نکته توجه داشت که هر کیت برای تشخیص اهداف خاص ایجاد شده است و یک کیت برای بررسی همه انواع نمونه‌ها مناسب نیست. هر کیت شامل معرف‌ها و بافرهای خاص هدف است. دانستن حساسیت و ویژگی کیت ELISA و نحوه تقویت هر مرحله،  از اهمیت بسیار بالایی برای داشتن یک آزمون الایزای موفق برخوردار است. شما باید در ابتدا پارامترهای مختلف برای انجام تست الایزا (مانند نوع آنتی بادی، زمان انکوباسیون، دما و سیستم گزارشگر) را بشناسید و در نظر بگیرید.

۲.  کیت مناسب را انتخاب کنید

قبل از انتخاب کیت، اطمینان حاصل کنید که کیت مورد نظر با هدف شما و ماهیت نمونه سازگار است. بررسی کنید که حساسیت کیت مناسب باشد. همچنین مطمئن شوید که آیا به کمک کیت مورد نظر، قادر به شناسایی هدف در نمونه‌ی خود هستید یا خیر. در حالت ایده‌آل، کیتی که انتخاب می‌کنید باید متناسب با نمونه مورد آزمایش شما ( پلاسما، سرم، ادرار، کشت بافت، بزاق و غیره) باشد.

۳. به نحوه صحیح آماده‌سازی نمونه توجه کنید

قبل از انجام آزمایش اصلی خود، با استفاده از یک نمونه کوچک دامنه رقت صحیح را تعیین کنید. توجه داشته باشید که مقدار نشانگرهای بیولوژیکی مورد آزمایش متفاوت خواهد بود. بنابراین حتما از راهنماهای موجود در کیت به عنوان مرجع استفاده کنید. لازم به ذکر است نمونه‌هایی که دارای فاکتورهای تداخلی مانند بیلی روبین هستند ممکن است باعث ایجاد خطا در نتایج شوند.

۴. به قابلیت تکرارپذیری توجه کنید

تکرارپذیری یکی از مسائل مهم در انجام هر آزمایشی است. توجه داشته باشید که برای دستیابی به نتایج دقیق، در نهایت لازم است داده‌هایی را در اختیار داشته باشید که قابلیت تکرار داشته باشند. به این منظور به موارد زیر توجه داشته باشید:

• قبل از انجام آزمایش، حدود ۳۰ دقیقه فرصت دهید تا معرف‌های کیت به دمای اتاق یا دمای مشخص شده در اطلاعات ارائه شده برسند. همچنین لازم است پیش از انجام آزمایش، نمونه‌های منجمد کاملاً ذوب شوند.
• شرایط محیطی را حفظ کنید، به عنوان مثال دما و رطوبت باید در طول آزمایش و بین سنجش نتایج ثابت باشد.
• اطمینان حاصل کنید که کلیه تجهیزات از جمله سمپلر ، پلیت و آنالایزر کالیبره هستند.
• از مقادیر کافی آنتی بادی استفاده کنید.
• سوبستراها باید تازه تهیه شده باشند.
• در طول آزمایش، نوک سمپلر و چاهک پلیت را به صورت بصری بازرسی کنید تا میزان حجم‌برداری و افزودن معرف کنترل شود.
• از معرف به مقدار زیاد استفاده نکنید. هر کیت‌ الایزا برای مقادیر خاصی طراحی شده است مخلوط کردن مقدار زیادی از نمونه و معرف می‌تواند بر عملکرد کیت تأثیر منفی بگذارد.
• هنگامی که معرف از بطری خارج شد، نباید آن را مجددا به بطری باز گرداند.
• اجازه ندهید که چاهک پلیت پس از شروع آزمایش خشک شود.

۵. شستشوی مناسب در هر مرحله الزامی است

همانطور که در قسمت‌های قبلی نیز توضیح داده شد، انجام تست الایزا مستلزم افزودن مواد مختلفی ( آنتی‌ژن ،آنتی‌بادی و …) در هر مرحله است. شستن پلیت به این دلیل انجام می‌شود که مواد اضافی (متصل نشده)  شسته شوند تا در نتایج اختلالی ایجاد نگردد. اطمینان حاصل کنید که حجم شستشو به اندازه کافی زیاد است تا تمام آثار آنتی ژن یا آنتی بادی اضافی را از چاهک‌ها پاک کند. چرخه شستشو را به اندازه کافی تکرار کنید تا اطمینان حاصل شود که آنتی‌ژن و آنتی بادیِ ناخواسته برداشته می‌شود اما آنتی بادی متصل شده در جای خود باقی می‌ماند.

۶. از آلودگی متقاطع غافل نشوید

آلودگی متقاطع یا cross contamination یکی از مشکلات رایج در آزمایش‌ها است که می‌تواند باعث بروز مشکلاتی جدی (از جمله از دست رفتن نمونه، وقت و سرمایه) و خطاهای قابل توجهی در نتایج شود.

قبل از شروع تست الایزا، مقدار معرف‌هایی که باید استفاده کنید را مشخص کنید. مقدار مناسب معرف را تهیه کرده و اضافی آن را دور بریزید. با تعویض نوک سمپلر بین هربار حجم‌برداری، از آلودگی متقاطع نمونه‌ها یا معرف‌ها خودداری کنید. حین شستن پلیت نیز از ظروف معرف جدید و یکبار مصرف استفاده کنید.

توجه: برای دفع سریع و آسان نوک سمپلرها ، یک سیفتی باکس را در دسترس خود قرار دهید.

۷. تکنیک مناسب را انتخاب کنید

همانطور که در قسمت‎‌های قبلی توضیح داده شد، برای انجام آزمایش الایزا ۴ تکنیک اصلی وجود دارد که هرکدام برای کاربردی خاص مناسب هستند. به همین دلیل برای داشتن یک آزمایش الایزا موفق، حتما نیاز و هدف آزمایش خود را در نظر گرفته و متناسب با آن، تکنیک آزمایش الایزا را انتخاب نمایید.

واژه نامه