آشنایی بیشتر با محیط کشت TCBS آگار
محیط کشت تیوسولفات سیترات نمک‌های صفراوی ساکاروز که به اختصار TCBS آگار نیز نامیده می‌شود، یک محیط کشت انتخابی و افتراقی است که برای جداسازی انتخابی گونه‌های ویبریو (Vibrio spp) از انواع نمونه‌های بالینی و غیر بالینی مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این مطلب قصد داریم تا به بررسی محیط کشت TCBS آگار، ترکیبات، روش آماده‌سازی و موارد استفاده از آن بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.
مروری بر باکتری‌های ویبریو
ویبریو به گونه‌هایی از باکتری اطلاق می‌شود که اغلب در آب یافت می‌شوند. از بیش از ۱۰۰ گونه‌ی شناخته شده‌ی ویبریو، حدود ۱۲ گونه باعث بروز عفونت در انسان می‌شوند.
ویبریو کلرا (Vibrio cholerae) باعث بروز بیماری وبا در انسان می‌شود که یک بیماری اسهالی شدید است و در صورت عدم درمانِ سریع، می‌تواند کشنده باشد.
سایر گونه‌های ویبریو (به‌عنوان مثال ویبریو پاراهمولیتیکوس [۱] و ویبریو آلجینولیتیکوس [۲]) باعث ایجاد ویبریوز می‌شوند. ویبریوز عفونتی است که معمولاً از طریق قرار گرفتن در معرض آب دریا یا از طریق مصرف غذاهای دریایی آلوده به صورت خام یا نپخته ایجاد می‌شود.
آشنایی با محیط کشت TCBS آگار
همانطور که در قسمت مقدمه نیز گفته شد، محیط کشت TCBS آگار ، یک محیط کشت انتخابی و افتراقی است که برای جداسازی گونه‌های ویبریو به کار می‌رود.
TCBS دارای pH بسیار بالایی (۸/۵-۹/۰) است که رشد فلورهای روده‌ای (غیر از گونه‌های Vibrio) را سرکوب می‌کند. نمک‌های صفراوی موجود در این آگار نیز از رشد میکروارگانیسم‌های گرم مثبت جلوگیری می‌کنند.
رنگ کلنی‌های ایجاد شده روی TCBS آگار، به توانایی ارگانیسم در تخمیر ساکاروز بستگی دارد. در صورت تخمیر ساکارز، کلنی‌های زرد رنگ و در صورت عدم تخمیر، کلنی‌ها سبز رنگ خواهند بود.
به‌طور مثال ویبریو کلرا در TCBS آگار کلنی‌های زرد ایجاد می‌کند، اما ویبریو پاراهمولیتیکوس [۵] کلنی سبز تولید می‌کند.
ترکیبات محیط کشت TCBS آگار
عصاره مخمر، پپتون باکتریولوژیکی: نیتروژن، ویتامین‌ها و اسیدهای آمینه موجود در TCBS آگار را تأمین می‌کند.
سدیم تیوسولفات، سدیم سیترات: عوامل انتخابی که pH قلیایی را برای مهار ارگانیسم‌های گرم مثبت و سرکوب کلی‌فرم‌ها تامین می‌کنند.
صفراي گاو: نمك‌هاي صفراوي رشد ميكروارگانيسم‌هاي گرم مثبت را مهار مي‌كنند.
ساکارز: کربوهیدرات قابل تخمیر که به تشخیص گونه‌ی ویبریو کمک می‌کند.
سدیم کلرید: رشد مطلوب و فعالیت متابولیکی هالوفیلی گونه‌ی ویبریو را فراهم می‌کند. ویبریوها برای رشد به نمک نیاز دارند که غلظت آن برای گونه‌های مختلف متفاوت است. این موضوع سبب تقسیم ویبریوها به دو دسته‌ی غیر هالوفیلیک (V. cholerae و V. mimicus) و گونه‌های هالوفیلیک می‌شود. گونه‌های غیر هالوفیلی در آگار مغذی رشد می‌کنند اما گونه‌های هالوفیلیک برای رشد نیاز به مکمل نمک در محیط کشت خود دارند.
فریک سیترات: فریک سیترات به همراه تیوسولفات سدیم به عنوان شاخصی برای تشخیص تولید سولفید هیدروژن عمل می‌کند.
آگار: عامل جامد کننده
تیمول بلو: نشانگر (اندیکاتور) pH
pH 8.6 ± ۰٫۲ در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد.
توجه: در محیط کشت TCBS آگار از افزایش pH برای افزایش رشد گونه‌های ویبریو استفاده می‌شود، زیرا معمولا این ارگانیسم‌ها به محیط‌های اسیدی حساس هستند.
تهیه محیط کشت TCBS آگار
آگار TCBS معمولا به صورت تجاری در دسترس است اما می‌توان آن‌را در آزمایشگاه نیز آماده کرد.
اگر از پودر آماده‌ی TCBS آگار استفاده می‌کنید، می‌توانید به روش زیر این محیط کشت را تهیه کنید. البته توجه داشته باشید که پیش از هرچیز مطالعه‌ی دستورالعمل‌های سازنده اهمیت دارد.
- ۸۸ گرم از پودر محیط کشت را در یک لیتر آب تصفیه شده حل کنید. (توجه داشته باشید که این مقدار ممکن است بسته به توصیه‌های سازنده متفاوت باشد).
- محلول را روی هات پلیت قرار دهید و یک دقیقه اجازه دهید تا مواد کاملا حل شود. محیط کشت را بیش از حد گرم نکنید.
توجه: محیط آماده شده را درون اتوکلاو قرار ندهید.
- محیط را به‌صورت آسپتیک در ظروف پتری دیش استریل پخش کنید. تاریخ آماده سازی محیط و کد مختص آن را روی ظرف درج نمایید.
- پتری دیش‌های حاوی محیط کشت را در دمای ۲-۸ درجه سانتی گراد و در کیسه‌های پلاستیکی مهر و موم شده نگهداری کنید.
چنانچه قصد آماده‌سازی محیط کشت TCBS آگار را دارید، برای اطلاع از میزان ترکیبات لازم، به جدول ۱ مراجعه کنید.
جدول ۱. میزان ترکیبات لازم برای تهیه محیط کشت TCBS آگار
| ماده | مقدار بر حسب گرم |
| ساکارز | ۲۰٫۰ |
| Dipeptone | ۱۰٫۰ |
| سدیم سیترات | ۱۰٫۰ |
| سدیم تیوسولفات | ۱۰٫۰ |
| سدیم کلرید | ۱۰٫۰ |
| عصاره مخمر | ۵٫۰ |
| صفرا (Ox gall) | ۵٫۰ |
| سدیم کولات | ۳٫۰ |
| فریک سیترات | ۱٫۰ |
| بیوتیمول بلو | ۰٫۰۴ |
| تیمول بلو | ۰٫۰۴ |
| آگار | ۱۵٫۰ |
میزان ماندگاری آگار: TCBS آگار هنگام تهیه سبز رنگ است. اگر تا ۴ هفته تغییری در ظاهر محیط ایجاد نشود (عدم آلودگی یا تغییر pH) می‌توان از محیط کشت استفاده نمود.
مورفولوژی برخی ارگانیسم‌ها در TCBS آگار
همانطور که پیش‌تر نیز گفته شد، میکروارگانیسم‌های مختلف بسته به ویژگی‌های خاص خود (مانند توانایی تخمیر ساکارز) کلنی‌های مختلفی روی TCBS آگار ایجاد می‌کنند که برخی از آن‌ها در جدول ۲ ذکر شده است.
جدول ۲.ارگانیسم‌های مختلف روی TCBS آگار
| میکروارگانیسم ها | مشخصات |
| ویبریو کلرا | کلنی‌های زرد مسطح به قطر حدودا ۲-۳ میلی‌متر |
| ویبریو آلجینولیتیکوس | کلنی‌های بزرگ زرد رنگ |
| ویبریو ولنیفیکوس | کلنی‌های زرد یا شفاف |
| ویبریو پاراهمولیتیکوس | کلنی‌های بی رنگ با مرکز سبز |
| انتروباکترها | کلنی‌های کوچک و بی رنگ شفاف |
محدودیت‌های استفاده از TCBS آگار
محیط کشت‌ها ابزاری پرکاربرد و مناسب جهت شناسایی میکروارگانیسم‌های مختلف هستند که در حوزه پزشکی و آزمایشگاهی کاربرد بسیار گسترده‌ای دارند. با این وجود باید توجه داشت که هر محیط کشت یکسری محدودیت‌ها نیز دارد. محیط کشتTCBS آگار نیز از این قاعده مستثنی نیست. در ادامه به بررسی محدودیت‌های استفاده از TCBS آگار خواهیم پرداخت.
- TCBS آگار ممکن است از رشد خوب برخی از گونه های Vibrio پشتیبانی نکند. (به عنوان مثال hollisae و V. metschnikovii).
- توصیه می‌شود از محیط‌های غیر انتخابی نیز همراه با محیط‌های انتخابی برای بازیابی بهتر ارگانیسم‌های بیماری‌زا استفاده شود.
- کشت روی TCBS اگار باید بلافاصله پس انکوباسیون بررسی شود. زیرا برخی کلنی‌های زرد رنگ مانند ویبرو کلرا ممکن است در دمای اتاق به رنگ سبز برگردند.
- در جداسازی اولیه، ویبریو پاراهمولیتیکوس ممکن است با آئروموناس هیدروفیلا [۶]، پلزیوموناس شیگلوئیدس [۷] و یا گونه‌های سودوموناس اشتباه گرفته شود.
- گونه‌های پروتئوس ساکارز را تخمیر می‌کنند و در نتیجه کلنی‌های زرد رنگی ایجاد که ممکن است شبیه به ویبریو باشد.
- TCBS یک محیط نامطلوب برای آزمایش اکسیداز گونه‌های ویبریو است.
- برخی از سویه‌های ویبریو کلزا ممکن است در TCBS آگار به دلیل تاخیر در تخمیر ساکارز سبز یا بی‌رنگ به نظر برسند.
جمع‌بندی
همانطور که در این مطلب گفته شد TCBS آگار یک محیط کشت مناسب برای بررسی و شناسایی گونه‌های ویبریو است. باکتری‌های ویبریو در این محیط کشت ( بسته به اینکه ساکارز را تخمیر می‌کنند یا نه) به رنگ زرد یا سبز مشاهده می‌شوند. اما همانطور که گفته شد، برای تشخیص قطعی، استفاده‌ی تنها از یک محیط کشت مناسب نیست و لازم است آزمایش‌های دیگری نیز برای تایید تشخیص صورت گیرد.
امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.
واژه نامه
| gastroenteritis | [۳] | Vibrio alginolyticus | [۲] | Vibrio parahaemolyticus | [۱] |
| Aeromonas hydrophila | [۶] | Vibrio parahaemolyticus | [۵] | V. vulnificus gastroenteritis | [۴] |
| Plesiomonas shigelloides | [۷] |
