رنگ آمیزی مثبت ویروسها چیست و چه زمانی استفاده ی‌شود؟
رنگ آمیزی مثبت ویروسها یکی از تکنیک‌های رنگ‌آمیزی برای بررسی و تمایز ویروسها در نمونه‌های بالینی است. این روش مشابه رنگ آمیزی منفی است. اما تفاوت آن این است که تصویر ویروس در پس‌زمینه‌ای روشن است، برخلاف رنگ‌آمیزی منفی که در آن یک تصویر از ذرات ویروسی روشن روی پس‌زمینه تیره تشکیل می‌شود. این تکنیک ساده است و به طور گسترده برای مطالعه مورفولوژی های متنوع ویروسها از محیط‌های آبی استفاده می‌شود. در ادامه قصد داریم به بررسی اصول این روش در آزمایشگاه بپردازیم. پس با ما همراه باشید.
اصول رنگ آمیزی مثبت ویروسها
همانطور که در قسمت مقدمه گفته شد، رنگ آمیزی مثبت ویروسها مشابه با تکنیک رنگ آمیزی منفی است، اما یکسری تفاوت‌ها نیز وجود دارد. این روش به نور حساس است و بنابراین باید در محیطی انجام شود که میزان نور در آن زیاد نیست. جهت رنگ آمیزی مثبت ویروسها ، نمونه در یک نمک فلز سنگین غوطه‌ور می‌شود. در رنگ‌آمیزی مثبت، اورانیل استات و یا سیترات سرب رایج‌ترین نمک‌های مورد استفاده هستند. سپس در معرض هوای محیط قرار می‌گیرد تا رنگ در اطراف مولکول‌های نمونه خشک شود.
توصیه می‌شود از فیلم کربن استفاده شود زیرا نتایج بهتری نسبت به فیلم پلاستیکی می‌دهد. دقت کنید که نمونه باید بین لایه کربن و لایه میکا قرار داده شود.
هنگامی که نمونه توسط فیلم کربن جذب شد، فیلم در حوضچه‌ای از رنگ شناور می‌شود. یک شبکه (توری) از جنس مس نیز در بالای فیلم کربن شناور در رنگ قرار می‌گیرد. به این ترتیب یک ساندویچ شبکه – کربن – نمونه ساخته می‌شود.
برای آشنایی بیشتر با رنگ آمیزی منفی، کلیک کنید.
سپس این مجموعه ساندویچی روی کاغذ صافی قرار داده می‌شود تا رنگ بگیرد و قبل از بررسی زیر میکروسکوپ الکترونی در مجاورت هوا خشک شود.
استفاده از میکروسکوپ الکترونی حداکثر وضوح را برای به دست آوردن یک تصویر رنگی از نمونه میسر می‌سازد. به همین دلیل ترجیحاً از میکروسکوپ الکترونی عبوری برای تجسم ویروسها و اجزای آن‌ها استفاده می‌شود.
نمونه‌هایی که در زیر میکروسکوپ الکترونی عبوری مشاهده می‌شوند باید برای ایجاد یک تصویر با کیفیت از نمونه به خوبی تثبیت، آبگیری، برش و رنگ آمیزی شوند.
شستشو یک فرآیند بسیار حیاتی برای رنگ آمیزی مثبت است. زیرا نمک‌های اضافی را از بین برده و تصویر بهتری از ویروسها ایجاد می‌کند.
کاربردهای رنگ آمیزی مثبت ویروسها
رنگ آمیزی مثبت ویروسها برای تجسم مورفولوژی‌های مختلف ویروس‌هایی مانند ارتومیکسوویروس‌ها، آدنوویروس‌ها، هپاتیت، رینوویروس‌ها و ویروس‌های آنفولانزا استفاده می‌شود.
این روش برای مطالعه ویژگی‌های فیزیولوژیکی ویروسها نیز کاربرد دارد.
علاوه‌براین، می‌توان از آن برای شناسایی و تمایز ویروس‌های مختلف مانند ویروس‌های حیوانی از ویروس‌های انسانی استفاده کرد.
مواد و شناساگرها
برای رنگ آمیزی مثبت ویروسها، یکسری مواد و لوازم نیاز است که در ادامه به مرور آن خواهیم پرداخت.
- فورسپس گرید EM (2جفت یا بیشتر)
- اورانیل استات
- آب فوق تصفیه شده
- پتری دیش
- ۴ لوله میکروسانتریفیوژ ۲ میلی لیتری با درب پیچی
- لوله کشت پلاستیکی ۴ میلی لیتری با درپوش
- هات پلیت
- کاغذ صافی (برش خورده)
- فیلتر سرنگ ۰٫۰۲ میکرومتر و سرنگ ۳ الی۵ میلی لیتری
- روپوش آزمایشگاهی، محافظ تنفسی (ماسک)، محافظ چشم
- تایمر
- سیفتی باکس برای دفع اوراسیل استات
روش تهیه اورانیل استات ۲ درصد برای رنگ آمیزی مثبت ویروسها
همانطور که گفته شد، در رنگ آمیزی مثبت ویروسها از اورانیل استات به عنوان فلز سنگین استفاده می‌شود. برای آماده‌سازی اورانیل استات ۲ درصد، ۰٫۰۴ گرم اورانیل استات را به ۲ میلی‌لیتر آب تصفیه شده اضافه کنید.
روش رنگ آمیزی مثبت ویروسها با استفاده از اورانیل استات
۲ میلی لیتر اورانیل استات ۲% را با آب فوق خالص شده در یک لوله کشت ۴ میلی لیتری بریزید. این لوله را روی هات پلیت به مدت ۳۰ دقیقه تا ۱ ساعت قرار دهید تا نمونه اورانیل استات کاملا مخلوط شود.
محلول اورانیل استات را با استفاده از یک فیلتر سرنگ ۰٫۰۲ میکرومتری در یک لوله ۲ میلی لیتری فیلتر کنید تا ذرات حل نشده حذف شوند.
لوله را با آب فوق تصفیه شده پر کنید.
شبکه را به مدت ۳۰ ثانیه در محلول غوطه ور کنید.
شبکه را به مدت ۱۰ ثانیه در آب فوق تصفیه شده فرو کنید.
شبکه را به مدت ۱۰ ثانیه در لوله دوم آب فوق تصفیه شده فرو کنید.
شبکه را به مدت ۱۰ ثانیه در لوله سوم آب فوق تصفیه شده فرو کنید.
با استفاده از یک کاغذ صافی که در لبه شبکه قرار داده شده است، مایع را از شبکه خارج کنید.
توری را در یک ظرف مخصوص توری قرار دهید و بگذارید یک شب خشک شود.
در نهایت آن را زیر میکروسکوپ الکترونی عبوری مشاهده کنید.
روش با استفاده از اورانیل استات و سیترات سرب
این روش باید در محیطی دور از نور و بدون CO2 انجام شود.
بخش فوق نازک نمونه به شبکه اضافه می‌شود.
شبکه با نمونه در اورانیل استات به مدت ۱۵ دقیقه انکوبه می‌شود.
سپس لازم است شبکه در آب فوق تصفیه، شسته شود.
شبکه‌ها در سیترات سرب به مدت ۴ الی ۵ دقیقه در محیطی بدون CO2 انکوبه می‌شوند. برای کاهش CO2 می‌توان از قرص‌های NaOH در طول آزمایش استفاده کرد.
در نهایت شبکه‌ها در هوا خشک می‌شوند و زیر میکروسکوپ الکترونی عبوری مشاهده می‌شوند.
تفسیر نتایج
رنگ‌آمیزی مثبت در زیر میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) تصویری تیره از ویروس و پس‌زمینه‌ای روشن را نشان می‌دهد. در این تصیویر مورفولوژی فیزیکی ویروس و هر عنصر ساختاری مانند پوشش ویروس آشکار می‌شود.
به عنوان مثال، با استفاده از اورانیل استات برای مطالعه آنتی ژن هپاتیت B، می‌توان انتشار ذرات ویروسی را در سراسر شبکه نشان داد.
مزایای رنگ آمیزی مثبت
- اجرای آن ساده است.
- انجام آن سریع است.
محدودیت های رنگ آمیزی مثبت ویروسها
واکنش خارجی با CO2 ممکن است بر نتیجه و جهت گیری مورفولوژی ویروسها تأثیر بگذارد.
همچنین قرار گرفتن در معرض پرتوهای نور کوچک ممکن است بر نتیجه نتایج تأثیر بگذارد.
سخن پایانی، پیشرفت در رنگ آمیزی مثبت ویروس ها
تکنیک رنگ آمیزی مثبت ویروسها یک تکنیک رایج در آزمایشگاه‌ها برای شناسایی و بررسی مورفولوژیکی ویروسها است. با پیشرفت علوم آزمایشگاهی، این تکنیک‌ها نیز درحال پیشرفت هستند. تکنیک‌های جدیدی با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری برای مشاهده مورفولوژی‌های جدید و ویژگی‌های فیزیولوژیکی ویروسها در حال توسعه هستند.
به عنوان مثال، روش رنگ آمیزی توکویاسو (TSP)، یک روش رنگ آمیزی مثبت با استفاده از اورانیل استات، گلوتارآلدئید و پلی وینیل الکل برای شناسایی و تجسم ویروس‌های بدون پوشش است. این‌ها شامل روتاویروس‌ها، ویروس‌های سرخجه، HIV-1، و ویروس لنفوتروپیک سلول T انسانی است.
