رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها چگونه است و کاربرد آن چیست؟

تکنیک‌های رنگ آمیزی برای ایجاد کنتراست در بررسی‌های میکروسکوپی طراحی شده‌اند. این تکنیک‌ها در آزمایشگاه‌های پاتولوژی و میکروبیولوژی کاربرد فراوانی دارند. یکی از رایج‌ترین تکنیک‌های رنگ آمیزی برای بررسی انواع ویروس‌ها، رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها است که برای افزایش کنتراست بین ویروس و پس زمینه انجام می‌شود.

البته تکنیک رنگ‌آمیزی منفی برای سایر میکروارگانیسم‌ها از جمله باکتری‌ها نیز کاربرد دارد که در مقالات قبلی به بررسی آن پرداخته شده است.

در این مطلب قصد داریم به بررسی تکنیک رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها در آزمایشگاه بپردازیم.

رنگ آمیزی منفی ویروس‌ها چیست؟

همانطور که در بخش مقدمه گفته شد، رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌‌ها برای ایجاد کنتراست بین پس‌زمینه و ویروس انجام می‌شود. این کار امکان بررسی و تشخیص ویروس زیر میکروسکوپ را راحت‌تر خواهد کرد. در واقع رنگ‌آمیزی منفی یکی از عالی‌ترین تکنیک‌ها در مطالعه ویروس‌ها و همچنین مورفولوژی‌های باکتریایی است.

در رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها، رنگ در اطراف ذره ویروسی قابل مشاهده است و ساختار آن‌را مشخص می‌کند. همچنین می‌تواند به برجستگی‌های کوچک اطراف ویروس که فیزیولوژی آن‌را توصیف می‌کنند، نفوذ کند. به این ترتیب هر گونه آسیب در اطراف ویروس آشکار می‌شود.

اصول رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها

رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها شامل استفاده از یک فیلم است که نمونه در آن قرار می‌گیرد.

غلظت ویروسی نمونه معمولا در حد ۰٫۰۵ و ۰٫۱ میلی گرم در میلی لیتر است. اما برای آدنوویروس‌ها و ویروس‌های آنفولانزا غلظت ۱ میلی‌گرم در میلی‌لیتر توصیه می‌شود.

جهت رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها ، نمونه در یک نمک فلز سنگین غوطه‌ور می‌شود. سپس در معرض هوای محیط قرار می‌گیرد تا رنگ در اطراف مولکول‌های نمونه خشک شود.

سپس نمونه روی یک فیلم نگهدارنده (نگهدارنده نمونه) گنجانده می‌شود. توصیه می‌شود از فیلم کربن استفاده شود زیرا نتایج بهتری نسبت به فیلم پلاستیکی می‌دهد. دقت کنید که نمونه باید بین لایه کربن و لایه میکا قرار داده شود.

هنگامی که نمونه توسط فیلم کربن جذب شد، فیلم در حوضچه‌ای از رنگ منفی شناور می‌شود. این رنگ منفی می‌تواند اورانیل استات (uranyl acetate) یا مولیبدات آمونیوم (ammonium molybdate) یا سیلیکوتانگستات سدیم (sodium silicotungstate) باشد.

یک شبکه (توری) از جنس مس نیز در بالای فیلم کربن شناور در رنگ قرار می‌گیرد. به این ترتیب یک ساندویچ -شبکه-کربن-نمونه ساخته می‌شود.

سپس این مجموعه ساندویچی روی کاغذ صافی قرار داده می‌شود تا رنگ بگیرد و قبل از بررسی زیر میکروسکوپ الکترونی در مجاورت هوا خشک شود.

استفاده از میکروسکوپ الکترونی حداکثر وضوح را برای به دست آوردن یک تصویر رنگی از نمونه میسر می‌سازد. به همین دلیل ترجیحاً از میکروسکوپ الکترونی عبوری برای تجسم ویروس‌ها و اجزای آن‌ها استفاده می‌شود.

نمونه‌هایی که در زیر میکروسکوپ الکترونی عبوری مشاهده می‌شوند باید برای ایجاد یک تصویر با کیفیت از نمونه به خوبی تثبیت، آبگیری، برش و رنگ آمیزی شوند.

انواع رنگ‌های مورد استفاده برای رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها

برای رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها ، نمونه باید به نمک‌های فلزی سنگین اورانیوم یا تنگستن آغشته شود. هر یک از این فلزات با pH‌های مختلف و همچنین بسته به نوع ویروسی که باید رنگ آمیزی شود، تهیه می‌شوند. در ادامه به بررسی رایج‌ترین فلزات مورد استفاده در رنگ‌آمیزی منفی ویروس‌ها خواهیم پرداخت.

۱- اورانیل استات

اورانیل استات (Uranyl acetate) حاوی اورانیوم و دارای pH پایین در حدود ۴٫۴ است. معمولاً برای رنگ‌آمیزی ویروس‌های پوشش‌دار استفاده می‌شود. این ماده، قسمت بالایی ذرات ویروس را رنگ می‌کند و فیلم پشتیبان رنگ نمی‌گیرد. از معایب این رنگ می‌توان به واکنش آن با  اسیدهای نوکلئیک، پروتئین‌ها و لیپیدها اشاره کرد که ممکن است یک نتیجه مثبت کاذب ایجاد کند. این ماده رادیواکتیو هم می‌باشد.

۲- سیلیکوتانگستات سدیم

سیلیکوتانگستات سدیم (Sodium silicotungstate) که به اختصار SST شناخته می‌شود حاوی تنگستن و اسید سیلیکوتنگستیک است. اسید در آب حل می‌شود، با NaOH خنثی می‌شود و با اتانول (سرد) رسوب می‌کند. به این ترتیب یک pH خنثی را تشکیل می‌دهد و از نظر شیمیایی یک رنگ بی‌اثر است. این رنگ به فیلم پشتیبان نزدیک می‌شود و ویژگی‌های مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی ویروس را که به فیلم متصل می‌شوند، مشخص می‌کند (از جمله پروتئین‌های ویروسی). اما این رنگ یک مولکول رنگ‌آمیزی‌ شده‌ی بزرگ تولید می‌کند که ممکن است برای تجسم دشوار باشد و وضوح تصویر را محدود کند. به همین دلیل برای تجسم پروتئین‌های کوچک ویروسی مناسب است.

۳- مولیبدات آمونیوم

یکی دیگر از رنگ‌های مورد استفاده در رنگ‌ آمیزی منفی ویروس‌ها ، مولیبدات آمونیوم (Ammonium molybdate) است که دارای pH خنثی می‌باشد. این رنگ پس از خشک شدن خیلی محکم به فیلم پشتیبان متصل می‌شود. بنابراین معمولا از آن برای تجسم ذرات بزرگ ویروسی مانند ارتومیکسوویروس‌ها استفاده می‌گردد. این رنگ کنتراست بالایی را در مقایسه با سایر رنگ‌ها ارائه می دهد.  اما فقط می‌تواند قسمت بیرونی ذرات را نشان دهد.

 در ادامه به بررسی نحوه رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها به کمک اورانیل استات خواهیم پرداخت.

مواد و لوازم مورد استفاده در رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها

• فورسپس گرید EM (2 جفت یا بیشتر)
• اورانیل استات
• آب فوق تصفیه شده
• ظرف کشت میکروب
• لوله‌های میکرو سانتریفیوژ ۲ میلی لیتری با درپوش
• لوله کشت پلاستیکی ۴ میلی لیتری با درپوش
• همزن کوچک
• هات پلیت
• کاغذ صافی (برش خورده)
• فیلتر سرنگ ۰٫۰۲ میکرومتر و سرنگ (۳ الی ۵ میلی لیتر)
• لوازم حفاظت فردی ازجمله روپوش آزمایشگاهی، محافظ تنفسی (ماسک) و محافظ چشم
• تایمر
• سیفتی باکس مناسب برای دفع اورانیل استات

روش تهیه اورانیل استات

۰٫۰۴ گرم اورانیل استات + ۲ میلی لیتر آب فوق خالص =  اورانیل استات ٪ ۲

روش رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها با استفاده از اورانیل استات

• ۲ میلی لیتر اورانیل استات ۲ درصد را با استفاده از آب فوق تصفیه شده در یک لوله ۴ میلی‌لیتری آماده کرده و هم بزنید. این ماده باید به مدت ۳۰ دقیقه الی ۱ ساعت مخلوط شود.
• محلول اورانیل استات را با استفاده از یک فیلتر سرنگ ۰٫۰۲ میکرومتری در یک لوله ۲ میلی لیتری فیلتر کنید تا ذرات حل نشده اورانیل استات حذف شود.
• به کمک فورسپس، شبکه را نگه دارید.
• سه قطره اورانیل استات را با استفاده از یک پیپت به قسمت براق توری اضافه کنید و اجازه دهید اضافه‌ی محلول دفع شود.
• یک قطره دیگر از اورانیل استات را به قسمت براق اضافه کنید و اجازه دهید ۴۵ ثانیه بماند.
• یک کاغذ صافی بردارید و لبه آن را با آب خیس کنید. با استفاده از لایه مرطوب کاغذ صافی، رنگ را از شبکه جدا کنید.
• توری را به کمک فورسپس روی یک پتری دیش خشک و به دور از هر گونه اشیا قرار دهید و حدود ۱ ساعت بگذارید تا خشک شود.
• در نهایت نمونه را زیر میکروسکوپ الکترونی مشاهده کنید.

موارد احتیاط هنگام رنگ آمیزی

هنگام  رنگ‌ آمیزی منفی ویروس‌ها حتما به نکات زیر توجه کنید.

• دقت کنید که اورانیل استات سمی است، بنابراین، هنگام استفاده از آن، حتما از روپوش آزمایشگاهی، محافظ چشم، ماسک تنفسی و دستکش استفاده کنید.
• اگر رنگ بیش از حد روی توری باقی بماند، حین بررسی نمونه زیر میکروسکوپ الکترونی تنها چیزی که خواهید دید، رنگ است.
• فیلم های پشتیبان می توانند فیلم های پلاستیکی یا فیلم های کربن نازک باشند. فیلم‌های پلاستیکی با گذشت زمان آبگریز می‌شوند، بنابراین نیاز به تمیز کردن مکرر دارند در حالی که فیلم‌های کربنی که اغلب نتایج بهتری دارند، با حرارت دادن کربن در دماهای بالا در خلاء، روی سطح میکای تازه شکافته شده (ورقه‌ای از فلز فلزی) تبخیر می‌شوند.

نتایج و تفاسیر

پس از رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها، میکروگراف‌های الکترونی مختلفی برای ویروس‌های مختلف خواهید دید که هریک ویژگی‌های ویروس‌ها را نشان می‌دهد.

• به عنوان مثال، آدنوویروس، فیبرهای بلندی را نشان می‌دهد.
• ارتومیکسوویروس‌ها سطوح میخ‌دار دارند.
• روتاویروس‌ها بسته به نوع نمونه، ذرات متعدد فشرده ویروس را نشان می‌دهند.

مزایا و معایب رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها

همانطور که در بخش‌های قبلی گفته شد، تکنیک رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها یک روش رایج و کاربردی برای بررسی ویروس و مورفولوژی آن زیر میکروسکوپ است. از مزایای این روش می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:

• اجرای آن آسان است.
• سریع است.
• برای انجام آن نیازی به تجهیزات خاصی نیست.
• رنگ‌آمیزی منفی بستری سریع برای تجسم پروتئین‌های کوچک ویروسی ارائه می‌دهد و به تعیین وضعیت الیگومری آن‌ها کمک می‌کند.

اما این روش معایب و محدودیت‌هایی نیز دارد. به عنوان مثال:

• در طول خشک شدن در هوا، نمونه‌های شکننده مانند ویروس‌های پوششی ممکن است رنگ لیپیدی را صاف کرده و از بین ببرند.
• در طول جذب، نیروهای مولکولی درگیر می‌توانند باعث تغییرات ساختاری از جمله کوچک شدن فیزیولوژیکی ویروس شوند و لیپیدها ممکن است سفت و فشرده شوند و تجسم را دشوار کنند.

جمع بندی

رنگ ‌آمیزی منفی ویروس‌ها یکی از تکنیک‌های آزمایشگاهی برای بررسی ویروس زیر میکروسکوپ الکترونی است. در این روش از فلزات سنگین برای رنگ آمیزی ویروس‌ها استفاده می‌شود. به این ترتیب کنتراست ایجاد شده بین ویروس و پس زمینه یک تصویر مناسب برای بررسی مورفولوژی ویروس ایجاد خواهد کرد.