پروتکل انجماد و دفریز سلول : راهنمایی برای دست‌یابی به نتایج قابل تکرار

پروتکل انجماد و دفریز سلول از دیرباز یکی از تکنیک‌های استاندارد در زیست شناسی سلولی بوده است. این فرآیند به عنوان کرایوپریزرویشن^[۱] نیز شناخته می‌شود.  انجماد و دفریز سلول باعث تکرارپذیری قابل توجهی در انجام یک آزمایش می‌شود. زیرا امکان استفاده از دسته‌های بسیار مشابه سلول‌ها را با فاصله ماه‌ها، سال‌ها یا حتی دهه‌ها فراهم می‌کند. همچنین به صرفه جویی در زمان، منابع و هزینه‌ها کمک می‌کند.

چالش کلیدی در انجماد و دفریز سلول، اطمینان از بقای سلولی و شاید مهم‌تر از آن، رفتار سلولی قابل پیش‌بینی و تکرارپذیر است. برای دستیابی به این هدف، دستورالعمل‌ها و پروتکل‌های مختلفی در طول زمان ایجاد شده است.

ما در این مطلب قصد داریم به بررسی این پروتکل‌ها بپردازیم.

مروری بر انجماد سلولی

پروتکل انجماد و دفریز سلول امری بسیار حساس است. زیرا در طول آن ممکن است سلول‌ها از بین بروند.

علت اصلی مرگ سلولی، هنگام انجماد، تشکیل یخ درون سلولی است. زمانی که سلول به‌طور نادرست منجمد می‌شود، کریستال‌های یخ می‌توانند در داخل سلول‌ها تشکیل شوند و به غشای سلولی و اندامک‌ها آسیب برسانند. در نتیجه شانس بازیابی سلول به‌طور قابل توجهی کاهش می‌یابد.

برای کمک به جلوگیری از تشکیل یخ درون سلولی، دو الزام ضروری برای هر پروتکل انجماد وجود دارد.

اولین مورد، افزودن یک عامل محافظت کننده در برابر سرما به محیط انجماد است. مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) یا گلیسرول.  این ترکیبات، به غشای سلولی نفوذ می‌کنند و معمولاً نقطه انجماد را کاهش می‌دهند. به این ترتیب از تشکیل کریستال یخ در داخل سلول‌ها جلوگیری می‌کنند.

دومین مورد، خنک شدن آهسته است. صرف نظر از نوع سلول، توصیه می‌شود انجماد سلولی، با سرعت ۱ درجه سانتی‌گراد در دقیقه در محدوده دمایی بین ۴ تا ۷۰- درجه سانتی‌گراد انجام شود.

این به نوبه خود منجر به تشکیل کمتر یخ در داخل سلول‌ها می‌شود. پس از انجماد کنترل شده، می‌توان ویال‌ها را برای نگهداری طولانی مدت به نیتروژن مایع (۱۵۰– تا ۱۹۶– درجه سانتی‌گراد) یا فریزرهای تخصصی (دمای ۱۵۰– درجه سانتی‌گراد) منتقل کرد.

بسیاری از کتب و منابع آنلاین اطلاعات دقیقی در مورد اصول و روش‌های انجماد سلولی ارائه می‌کنند.  اما اغلب توجه کمی به ملاحظات مرتبط با فرآیند دفریز سلول دارند.

به همین دلیل ما در ادامه به بررسی اصول ذوب سلول و توصیف روش‌های مختلف انجام این فرایند خواهیم داشت.

پروتکل دفریز سلول

همانطور که گفته شد، انجماد سلولی باید با سرعت آهسته و کنترل شده اتفاق بیفتد. در مقابل، دفریز سلول‌‌های منجمد (Cell Thawing) زمانی بهترین کارایی را دارد که سریع انجام شود.

یک پروتکل معمولی ذوب سلولی، معمولاً با بازیابی ویال‌ها از نیتروژن مایع آغاز می‌شود.

توجه داشته باشید که حین کار با نیتروژن مایع حتما از تجهیزات حفاظت فردی استفاده کنید. همچنین به خاطر داشته باشید که پس از حذف نیتروژن مایع از ویال، فشار داخل لوله سریعا افزایش می‌یابد. بنابراین پوشیدن محافظ صورت ضروری است.

در مرحله بعد، ویال‌ها باید ذوب شوند. بر اساس یک قانون کلی، با شروع فرآیند دفریز سلولی در یک کریوویال استاندارد حاوی یک سوسپانسیون ۱ میلی لیتری، تمامی یخ‌ها باید ظرف چند دقیقه ناپدید شوند. حین ذوب سلولی ممکن است تبلور رخ دهد که می‌تواند باعث آسیب سلولی شود. گرمایش سریع، از تبلور مجدد موضعی در طول ذوب جلوگیری می‌کند.

از بین بردن اثرات محیط انجماد

پروتکل دفریز سلول ، به ذوب کردن ختم نمی‌شود. هنگامی که تمام یخ ناپدید شد، باید اثرات نامطلوب عوامل محافظت کننده در برابر سرما را کاهش داد. همانطور که در بخش‌های قبل گفته شد، برای کاهش نقطه انجماد، از موادی مانند دی متیل سولفوکسید (DMSO) یا گلیسرول استفاده می‌شود. پس از دفریز کردن، باید اثرات این مواد را کاهش داد.

دو راه برای انجام این کار وجود دارد.

اولین مورد، کشت مستقیم سلول‌ها است. پس از دفریز سلول، می‌توان سلول‌های موجود در یک کرایو ویال را درون یک فلاسک کشت داد. به این ترتیب با استفاده از محیط کشت، محیط انجماد حداقل به میزان ده برابر رقیق می‌شود. در نتیجه از اثرات مخرب آن روی سلول کاسته خواهد شد.

راه دیگر، استفاده از سانتریفیوژ است. به این منظور، ابتدا محیط انجماد با محیط کشت معمولی رقیق می‌شود. سپس لوله سانتریفیوژ می‌گردد. پس از جدا شدن سلول‌ها از محیط، محیط دور ریخته شده و سلول‌ها مجدداً در محیط کشت تازه قرار می‌گیرند.

برای بررسی موفقیت آمیز بودن پروتکل ذوب سلولی، توصیه می‌شود درصد سلول‌های زنده را بررسی کنید. برای این کار می‌توان از تکنیک رنگ آمیزی تریپان بلو یا دستگاه شمارنده سلول کمک گرفت.

همچنین توصیه می‌شود کشت سلول را به مدت چند روز، مداوم بررسی کنید. هر گونه ناهنجاری در شکل یا سرعت رشد، ممکن است نشانه‌ای از مشکلات فرآیند انجماد و دفریز سلول باشد. پس تشخیص زودهنگام می‌تواند خطاهای آزمایش را کاهش دهد.

روش‌های دفریز سلول

روش‌ها و تجهیزات مختلفی برای دفریز سلول‌ وجود دارد. در ادامه به بررسی این روش‌ها خواهیم پرداخت.

۱. استفاده از حمام آب برای دفریز سلول

بدون شک، متداول ترین روش مورد استفاده برای دفریز سلول‌ در آزمایشگاه، استفاده از حمام آب  (Waterbath) است. این روش به ذوب سریع کمک می‌کند. در مقابل از گرمای بیش از حد موضعی داخل ویال نیز جلوگیری می‌کند.

از طرف دیگر، حمام آب بخشی از تجهیزات استاندارد مورد استفاده در آزمایشگاه کشت سلولی است. بنابراین نیازی به سرمایه گذاری اضافی ندارد.

هنگام گرم کردن سلول‌ها با استفاده از حمام آب، سلول‌ها نباید در معرض دمای بالاتر از ۳۷ درجه سانتی‌گراد قرار گیرند. این دما می‌تواند منجر به اثرات نامطلوب و حتی مرگ سلولی شود.

یک ایراد مهم حمام آب، آلودگی ناشی از تماس بین آب و نمونه است. خشک نگه داشتن قسمت بالایی ویال حین دفریز سلول، کار دشواری خواهد بود. به همین دلیل لازم است نمونه به طور پیوسته بررسی شود.

۲. دفیرز سلول با استفاده از حرارت دست

گرم کردن کریوویال‌ها با دست (Hand-warming) می‌تواند یک روش وسوسه انگیز باشد. این روش به چند دلیل مورد توجه قرار گرفته است:

۱. به هیچ تجهیزاتی نیاز ندارد.

۲. دمای بدن شبیه به حمام آب است.

۳. کاربر می‌تواند ویال را به طور مداوم بررسی کند.

با این وجود، لازم به ذکر است که در این روش انتقال حرارت نسبت به حمام آب کمتر خوهد بود. در نتیجه دفریز سلول کندتر انجام خواهد شد. پس ممکن است تکرار‌پذیری نتایج و حساسیت آزمایش کاهش یابد.

۳. حمام مهره

حمام مهره (Bead bath) یک روش جایگزین برای حمام آب است. اما کارایی آن مشابه گرم کردن با دست یا گرم کردن در هوا (به عنوان مثال در انکوباتور) است.

به این معنی که این روش به اندازه‌ی حمام آب کارآمد نیست. زیرا مهره‌ها انتقال حرارت را به اندازه‌ی حمام آب فراهم نمی‌کنند.

حین استفاده از حمام آب ،لازم است محفظه مداوما از آب پر شود. اما در این روش نیازی به پر کردن مجدد محفظه نیست. به همین دلیل حمام مهره گاهی توسط آزمایشگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.

با این وجود، در طولانی مدت، به دلیل تجمع گرد و غبار ممکن است نیاز به تخلیه محفظه و پرکردن مجدد آن باشد.

۴. دستگاه‌های اختصاصی

در دهه‌های اخیر، دستگاه‌های تخصصی‌ای تولید شده است که  به دفریز سلول کمک می‌کنند. بیشتر آن‌ها برای کرایویال‌ها طراحی شده‌اند. اما سیستم‌هایی نیز وجود دارند که می‌توانند حجم‌های بزرگ‌تری را پوشش دهند. این سیستم‌ها، فرآیند ذوب را در یک روش تکرارپذیر انجام می‌دهند. به همین دلیل بسیار مورد توجه هستند. همچنین برای موقعیت‌هایی که استفاده از حمام آب امکان پذیر نیست، مناسب می‌باشند.

 مهم‌ترین نقطه ضعف دستگاه‌های ذوب، هزینه‌ اولیه است. علاوه‌براین، برخی از این دستگاه‌ها تنها قادر به ذوب یک ویال در یک زمان هستند. به همین دلیل از سرعت انجام کارهای آزمایشگاه می‌کاهند.

کدام روش دفریز سلول برای آزمایشگاه شما مناسب است؟

انتخاب روش مناسب دفریز سلول در آزمایشگاه اهمیت زیادی دارد. اما پیش از انتخاب آن باید به یک‌سری نکات نیز توجه داشت. در ادامه به بررسی این موارد خواهیم پرداخت.

۱. ملاحظات خاص آزمایشگاهی

هنگام مقایسه روش‌های مختلف ذوب سلولی، ناگزیر ملاحظات خاص آزمایشگاهی زیادی نقش دارند. به‌عنوان مثال اتاق‌های تمیز یا کلین روم‌‌ها. استفاده از حمام آب در کلین روم‌ها، می‌تواند منبع آلودگی هوا تلقی شود. پس لازم است از روش‌های جایگزین استفاده گردد.

البته بودجه موجود برای تجهیزات آزمایشگاهی نیز نقش کلیدی در انجام ذوب سلولی دارد.

۲. ملاحظات نوع سلول

بسیاری از پروتکل‌های انجماد و دفریز سلول ، برای تمامی انواع سلول‌ها کاربرد دارد. اما توجه داشته باشید که ممکن است برخی سلول‌ها نیاز به انجام روش‌های خاصی داشته باشند. به همین دلیل توصیه می‌شود پیش از انجام این فرایند، ابتدا به رده سلولی توجه کنید.

یکی از جنبه‌هایی که در هر نوع سلول متفاوت است و باید به دقت بررسی شود، مدت زمانی است که طول می‌کشد تا سلول‌ها رشد طبیعی خود را از سر بگیرند و به محرک‌ها، پاسخ طبیعی نشان دهند.

به همین دلیل زمانی‌که “سرعت تکثیر” یک پارامتر کلیدی در یک مطالعه است، آزمایش‌ نباید با سلول‌هایی که به طور کامل دفریز نشده‌اند، انجام شود.

سخن پایانی

تکرارپذیری نتایج، یک موضوع بسیار مهم در آزمایشگاه‌ها است. در آزمایشگاه‌های کشت سلولی، این امر تا حد زیادی به پروتکل انجماد و دفریز سلول بستگی دارد.

ذوب سلولی را می‌توان با استفاده از روش‌های مختلف انجام داد. اما انتخاب پروتکل ذوب سلولی مناسب به عوامل مختلفی بستگی دارد. به عنوان مثال، زیرساخت‌ها و بودجه آزمایشگاه و نوع رده سلولی

ما در این مطلب سعی کردیم تا ضمن بیان اهمیت انجماد و دفریز سلول، روش‌های مختلف انجام ذوب سلولی را نیز مرور کنیم.

شما در آزمایشگاه خود بیشتر از کدام روش استفاده می‌کنید؟

واژه نامه