همانطور که می‌دانید در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی و بالینی از روش‌های مختلفی برای تمایز میکروارگانیسم‌ها استفاده می‌شود. تست vp نیز یکی از این روش‌ها است.

اکثر باکتری‌ها قادر به تخمیر (متابولیسم) گلوکز هستند. اما محصول نهایی متابولیسم گلوکز توسط باکتری‌های مختلف ممکن است همیشه یکسان نباشد. به دنبال گلیکولیز، برخی مسیر تخمیر اسیدی را دنبال می‌کنند تا پیروات را به یک مخلوط اسید آلی پایدار تبدیل کنند. در حالی که برخی دیگر مسیر بوتیلن گلیکول^[۱] را برای تولید استیل متیل کاربینول^[۲] (استوئین) و بوتاندیول^[۳] دنبال می‌کنند.

تست VP یک آزمایش بیوشیمیایی است که توانایی باکتری‌ها را برای متابولیزه کردن پیرووات به یک محصول میانی خنثی به نام “استیل متیل کاربینول” یا “استوئین” تشخیص می‌دهد.

در ادامه بیشتر به اصول انجام این روش و نتایج حاصل از آن برای باکتری‌های مختلف خواهیم پرداخت. پس با ما همراه باشید.

تست VP چیست و چرا انجام می‌شود؟

تست VP یا Voges-Proskauerبخشی از سری آزمایش‌های IMViC است. در مقاله تست IMViC توضیح دادیم که این تست در واقع مجموعه ای از چهار آزمایش بیوشیمیایی است که برای تمایز و شناسایی باکتری‌های گرم منفی، به ویژه انتروباکتریاسه ها استفاده می‌شود.

این آزمایش برای اولین بار توسط Daniel W. O. Voges و Bernhard Proskauer در سال ۱۸۹۸ توصیف شد. از آن زمان به بعد، چندین بار اصلاح شد. در سال ۱۹۳۶ بود که Barritt استفاده از α-نفتول و KOH را برای به دست آوردن نتایج واضح‌تر پیشنهاد کرد. امروزه آزمایش VP اصلاح شده به طور گسترده‌ای برای شناسایی باسیل‌های گرم منفی و اکتینوباکترها^[۴] استفاده می‌شود.

تست VP جهت شناسایی و تمایز باسیل‌های گرم منفی (عمدتا انتروباکتریاسه ‌ها) و اکتینوباکتری‌ها استفاده می‌شود.

همانطور که در بخش مقدمه نیز گفته شد، اکثر باکتری‌ها قادر به تخمیر (متابولیسم) گلوکز هستند. اما محصول نهایی متابولیسم گلوکز توسط باکتری‌های مختلف ممکن است همیشه یکسان نباشد. تست VP یک آزمایش بیوشیمیایی است که توانایی باکتری‌ها را برای متابولیزه کردن پیرووات به یک محصول میانی خنثی به نام “استیل متیل کاربینول” یا “استوئین” تشخیص می‌دهد.

اصول VP Test

تست Voges-Proskauer برای تعیین این موضوع استفاده می‌شود که آیا یک میکروارگانیسم زنده از تخمیر گلوکز استیل متیل کاربینول تولید می‌کند یا خیر. در صورتی که پاسخ مثبت باشد، استیل متیل کاربینول در حضور ∝- نفتول، قلیای قوی (۴۰٪ KOH) و اکسیژن به دی استیل تبدیل می‌شود. ∝-نفتول در ابتدا بخشی از روش اصلی نبود. اما بعدها مشخص شد که به عنوان یک تشدید کننده رنگ عمل می‌کند. بنابراین استوئین تولید شده در حضور KOH (هیدروکسید پتاسیم) و اکسیژن (O2) به دی استیل اکسید می‌شود. دی استیل تولید شده، در حضور ∝-نفتول، با جزء گوانیدین پپتون واکنش داده و رنگ صورتی تا قرمز را تشکیل می‌دهد.

الزامات برای انجام تست VP

انجام این تست بیوشیمیایی مستلزم یکسری محلول‌ها و تجهیزات است که در ادامه به بررسی آن‌ها خواهیم پرداخت.

۱- محیط کشت

آبگوشت MR-VP که با نام گلوکز فسفات براث نیز شناخته می‌شود برای انجام تست VP استفاده می‌شود. ترکیب MR-VP Broth در هر ۱۰۰۰ میلی لیتر به شرح زیر است.

پپتون بافر – ۷٫۰۰ گرم
دکستروز (گلوکز) – ۵٫۰۰ گرم
دی پتاسیم فسفات – ۵٫۰۰ گرم

pH نهایی – ۰٫۲±۶٫۹ در دمای ۲۵ درجه سانتی گراد

روش تهیه آبگوشت MR-VP برای انجام تست VP به شرح زیر است:

مقدار مناسب پودر آبگوشت MR-VP (17.0 گرم در ۱۰۰۰ میلی لیتر) را اندازه‌گیری کرده و آن را در آب با حجم مورد نیاز در یک فلاسک (یا بطری شیشه ای) حل کنید.
محلول را روی هات پلیت قرار دهید تا پودر محیط کشت کاملا حل شود.
حدود ۵ تا ۱۰ میلی لیتر از آبگوشت را در یک لوله آزمایش تمیز بریزید و درب آن را ببندید.
لوله های آزمایش را در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد و فشار ۱۵ پوند به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو کنید. قبل از تلقیح اجازه دهید محیط کشت تا دمای زیر ۴۰ تا ۴۵ درجه سانتیگراد خنک شود.

۲- معرف‌های لازم برای تست VP

برای انجام این تست، محلول آلفا نفتول ۵% ( معرف باریت A) و محلول ۴۰% KOH یا NaOH (معرف باریت B) مورد نیاز است.

تهیه معرف باریت A

۵ گرم معرف آلفا نفتول را در ۱۰۰ میلی لیتر اتانول ۹۵ درصد حل کنید. معرف را می‌توان تا ۳ هفته در مکانی تاریک در دمای ۴ تا ۸ درجه سانتی گراد نگهداری کرد.

تهیه معرف باریت B

۴۰ گرم پودر KOH را در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر استریل حل کنید. معرف را می‌توان تا ۳ هفته در دمای ۴ تا ۸ درجه سانتی گراد نگهداری کرد.

۳- تجهیزات

لوله‌های آزمایش
قطره چکان
انکوباتور
چراغ Bunsen
دستگاه توزین
لوپ تلقیح

۴- ارگانیسم مورد آزمایش

نمونه حاوی باکتری مشکوک

۵- ارگانیسم کنترلی

اشریشیا کلی ATCC 25922
کلبسیلا پنومونیه ATCC 13883

مراحل انجام تست VP

با استفاده از یک لوپ تلقیح استریل، مقداری از کلنی‌های رشد کرده را برداشته و در آبگوشت تلقیح کنید. توصیه می‌شود از کلنی‌هایی که بعد از ۱۸ تا ۲۴ ساعت انکوبه شدن رشدکرده اند استفاده شود.

لوله‌ها را به مدت ۱۸ تا ۲۴ ساعت به صورت هوازی در دمای ۲±۳۵ درجه سانتی گراد انکوبه کنید.

پس از انکوباسیون، ۲ میلی لیتر آبگوشت را به یک لوله آزمایش تمیز (در صورت امکان استریل) منتقل کنید.

۶ قطره از معرف A (محلول ۵% آلفا نفتول) را اضافه کرده و با تکان دادن به خوبی مخلوط کنید.

۲ قطره از معرف B (محلول ۴۰% KOH) را اضافه کرده و با تکان دادن به خوبی مخلوط کنید.

برای تشکیل رنگ قرمز صورتی در سطح محیط ۳۰ دقیقه صبر کنید. در طول دوره انتظار ۳۰ دقیقه‌ای، لوله را به طور مداوم تکان دهید.

اگر رنگی ایجاد نشد (واکنش منفی) باقیمانده آبگوشت را مجدداً به مدت ۲۴ ساعت دیگر انکوبه کنید و دوباره آزمایش را تکرار کنید.

تفسیر نتایج آزمون VP

نتیجه مثبت با تشکیل یک رنگ صورتی-قرمز بر روی سطح محیط نشان داده می‌شود.
نتیجه منفی با فقدان رنگ صورتی-قرمز روی سطح محیط یا تشکیل رنگ مسی نشان داده می‌شود.

کنترل کیفیت

همانطور که در بخش‌های قبلی نیز گفته شد، تست VP مانند هر آزمایش دیگری، نیازمند کنترل کیفی است. این کار با استفاده از ارگانیسم‌هایی انجام می‌شود که از نتایج واکنش آن‌ها در این محیط کشت مطمئن هستیم.

کلبسیلا پنومونیه ATCC 13883 نتایج مثبتی به دست می‌دهد. یعنی رنگ صورتی مایل به قرمز را روی سطح محیط ایجاد می‌کند.

در مقابل، اشریشیا کلی ATCC 25922 نتایج منفی می‌دهد. یعنی رنگ صورتی مایل به قرمز روی سطح محیط ایجاد نمی‌کند.

نتایج تست VP برخی از باکتری‌های رایج

در جدول زیر نتایج تست Voges-Proskauer برای برخی از باکتری‌های رایج نشان داده شده است.

VP Negative Bacteria	VP Positive Bacteria
Escherichia spp.,	Klebsiella spp.,
Proteus vulgaris,	Enterobacter spp.,
Citrobacter freundii,	Viridans Streptococci (except S. mitis, and S. vestibularis)
Morganella morganii,	Proteus mirabilis,
Shigella spp.,	Hafnia spp.,
Yersinia spp.,	Serratia spp.,
V. parahaemolyticus	Staphylococcus aureus,
Escherichia spp.,	Listeria spp.,
	V. cholerae

موارد احتیاط

توجه داشته باشید که تلقیح بیش از حد منجر به مهار رشد باکتری می‌شود. بنابراین، بهتر است تلقیح باکتری را به میزان کمتر از ۱۰^۹ سلول در هر میلی لیتر آبگوشت محدود کنید.

از معرف‌های تازه تهیه شده استفاده کنید. اگر معرف‌ها نیاز به نگهداری دارند، همیشه آن‌ها را در مکانی تاریک نگهداری کنید.
محیط و معرف را با تکان دادن شدید به خوبی مخلوط کنید تا اکسیژن به خوبی در آن حل شود.
تا ۳۰ دقیقه پس از افزودن معرف‌ها، در حالی که به طور مداوم تکان می دهید، صبر کنید تا نتیجه درستی را مشاهده کنید.
انکوباسیون بیش از حد (بیش از ۳ روز انکوباسیون) را ممنوع کنید زیرا می‌تواند واکنش منفی ضعیف یا کاذب بدست بدهد.
مقدار بیش از حد KOH یک واکنش ضعیف مثبت ایجاد می‌کند. بنابراین از معرف‌ها به مقدار مناسب استفاده کنید.

گیف تبلیغاتی لام های شرکت پل ایده آل پارس

محدودیت‌های VP Test

تست VP برای تمایز گونه‌های باکتریایی استفاده می‌شود. اما یکسری محدویت نیز دارد. این یک آزمایش تاییدی نیست و برای تایید شناسایی باکتری به نتایج سایر آزمایشات بیوشیمیایی نیاز دارید.

گاهی اوقات نتیجه مثبت بعد از ۳۰ دقیقه تا ۱ ساعت به دست می‌آید. اما خواندن نتیجه بعد از ۱ ساعت ممکن است نتیجه مثبت کاذب بدست بدهد.

سخن پایانی

تست VP برای تعیین اینکه آیا یک میکروارگانیسم زنده از تخمیر گلوکز استیل متیل کاربینول تولید می‌کند یا خیر استفاده می‌شود. در صورت وجود، استیل متیل کاربینول در حضور ∝- نفتول، قلیایی قوی (۴۰٪ KOH) و اکسیژن اتمسفر به دی استیل تبدیل می‌شود.

این یکی از آزمایشات بیوشیمایی مهم برای برای شناسایی و تمایز باکتری‌های گرم منفی، در درجه اول در انتروباکتریاسه ها و افتراق اکتینوباکتری‌ها است.

امیدواریم این مطلب مورد توجه شما قرار گرفته باشد.

واژه نامه