تکنیک رنگ آمیزی متیل گرین پیرونین Y برای DNA و RNA

تکنیک رنگ آمیزی متیل گرین پیرونین Y (green-pyronin Y procedure) بیش از ۱۰۰ سال پیش ابداع شد. از آن زمان به بعد، به یک روش هیستوشیمیایی برای نمایش افتراقی DNA و RNA تبدیل شد. در این مطلب قصد داریم به بررسی مراحل تکنیک متیل گرین – پیرونین بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

مروری بر تکنیک متیل گرین پیرونین

تکنیک رنگ آمیزی متیل گرین پیرونین با نام اختصاری MGP نیز شناخته می‌شود. به کمک این روش می‌توان هم DNA و هم RNA را رنگ آمیزی و مشاهده کرد.

این روش رنگ‌آمیزی اولین بار توسط Pappenheim  در سال ۱۸۹۹ ابداع شد.  بعدها در سال ۱۹۰۲ توسط فردی به نام Unna اصلاح شد. از آن زمان تاکنون تغییرات زیادی در تکنیک اصلی ایجاد شده است. اما تکنیک رنگ آمیزی متیل گرین – پیرونین، هنوز هم یک روش هیستولوژی پرکاربرد در آزمایشگاه‌ها است.

هر دو رنگ استفاده شده در این روش، کاتیونی هستند. یعنی بار مثبت دارند.

متیل گرین یک رنگ ناخالص حاوی متیل ویولت است. هنگامی که متیل ویولت شسته می‌شود (توسط کلروفرم)، متیل گرین خالص شده و به طور خاص به DNA متصل می‌شود.

از طرف دیگر پیرونین هر ماده‌ی موجود در بافت که دارای بار منفی باشد را به رنگ قرمز در می‌آورد. در واقع در عمل، نه تنها RNA، بلکه موسین‌های اسیدی موجود در اپیتلیوم و غضروف بافت نیز رنگ می‌گیرند.

لازم به ذکر است که این دو رنگ ذاتاً به DNA و RNA وابسته نیستند. انتخاب پذیری آن‌ها نتیجه یک مقدار pH مشخص است.

برای به دست آوردن رنگ افتراقی، یک بافر به محلول اضافه می‌شود تا به pH 4.8 برسد. اگر pH کمتر از ۴٫۸ باشد، رنگ قرمز ناشی از پیرونین غالب می‌شود. اگر pH بالاتر باشد، رنگ سبز-آبی ناشی از متیل گرین غالب می‌شود.

مواد و محلول‌های لازم در تکنیک رنگ آمیزی متیل گرین پیرونین

تثبیت کننده: بافر فرمالین خنثی ۱۰٪.

برای تثبیت کردن، ممکن است از فیکساتورهای دیگری نیز استفاده شود. به‌عنوان مثال Carnoy’s، formol saline و Zenker.

اما از تثبیت کننده‌هایی با غلظت فرمالدئید بالاتر از ۱۰% استفاده نکنید. زیرا غلظت‌های بالاتر، گروه‌های آمینی DNA را مسدود می‌کند.

همچنین هرگز از تثبیت کننده‌های اسیدی استفاده نکنید. زیرا واکنش را متوقف کرده و باعث هیدرولیز می‌شوند.

در رنگ آمیزی متیل گرین پیرونین حین پارافین گیری باید از دمای بالا اجتناب شود. در غیر این صورت، فاصله بین گروه‌های فسفریک در مولکول DNA برای متیل گرین خیلی زیاد می‌شود و این رنگ نمی‌تواند روی آن‌ها تاثیر بگذارد.

محلول‌‌ها

• اسید استیک ۰٫۲ مولار:
• اسید استیک گلاسیال ————— ۳٫۰ میلی‌لیتر
• آب مقطر ———————————– ۲۴۷٫۰ میلی‌لیتر

• سدیم استات ۰٫۲ مولار:
• سدیم استات بی آب ————————  ۴٫۱ گرم
• آب مقطر ————————————– ۲۵۰٫۰ میلی‌لیتر

• اسید استیک-استات سدیم ۰٫۲ مولار با  pH 4.2
• اسید استیک ۰٫۲ مولار ———————— ۷۵٫۰  میلی‌لیتر
• سدیم استات ۰٫۲ مولار ———————— ۲۵٫۰ میلی‌لیتر

pH را روی ۴٫۲ تنظیم کنید. برای این کار می‌توانید مقداراسید استیک یا سدیم استات را تغییر دهید.

توجه: این محلول باید در یخچال با دمای ۳ تا ۶ درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.

• محلول متیل گرین ۵%
• محلول بافر ۰٫۲ مولار استات ——————-     ۱۰٫۰۰ میلی‌لیتر
• متیل گرین ——————————–۰٫۰۵ گرم

• متیل گرین – محلول پیرونین Y
• محلول متیل گرین ۵% ———————— ۱۰۰۰۰ میلی لیتر
• پیرونین    —————————— ۰٫۰۰۵ گرم

توجه: مقدار پیرونین Y ، بسته به برندی که استفاده می‌شود، ممکن است به اندازه‌ی ۰٫۰۱ گرم افزایش یابد.

مراحل رنگ آمیزی متیل گرین – پیرونین

مراحل رنگ آمیزی متیل گرین پیرونین چندان سخت نیست.  توصیه می‌شود از لام کنترل استفاده کنید. لام کنترلی به معنای آماده سازی ماده‌ای است که برای ایجاد یک واکنش خاص شناخته شده است. این ماده روی یک لام شیشه‌ای ثابت شده و در فرآیند کنترل کیفیت استفاده می‌شود.

۱. مراحل پارافین زدایی و هیدراسیون بافت را انجام دهید.

۲. لام را روی سینی رنگ آمیزی قرار دهید. محلول متیل گرین – پیرونین Y را روی لام بریزید. اجازه دهید ۵ دقیقه بماند.

۳. لام‌ها را با آب مقطر بشویید و سپس آن را کاملا با دستمال مخصوص خشک کنید.

۴. لام را به مدت ۱۰ ثانیه در استون قرار دهید.

۵. سپس آن‌را چند بار به مقدار مساوی به استون و زایلن آغشته کنید.

۶. مراحل شفاف سازی را انجام دهید.

نتایج رنگ آمیزی متیل گرین پیرونین

• DNA ——————————————- آبی تا سبز آبی
• RNA —————————————— صورتی تا قرمز
• زمینه ——————————————- صورتی کمرنگ

جمع‌بندی

تکنیک متیل گرین پیرونین یک روش کاربردی در آزمایشگاه‌های هیستوپاتولوژی است. از این روش برای نشان دادن همزمان DNA و RNA در بخش‌های بافت شناسی استفاده می‌شود. در این مطلب و در ادامه‌ی مجموعه مقالات رنگ آمیزی در آزمایشگاه، سعی کردیم به بررسی تکنیک متیل گرین – پیرونین بپردازیم و نکات استقاده از این روش را بیان کنیم.

آیا شما نیز در آزمایشگاه خود از این روش استفاده می‌کنید؟

آیا می‌دانید چه روشی را می‌توان جایگزین متیل گرین کرد؟

نظرات و تجربیات خود را به صورت دیدگاه با ما و دیگر خوانندگان این مطلب به اشتراک بگذارید.