آزمایش‌ها و آزمایشگاه

شناسایی باسیل‌های گرم منفی: مروری سریع بر هلیکوباکتر (عامل زخم‌های گاستریک و دودنال)

تهیه و تنظیم: دکتر محمد قهری

گونه‌های هلیكوباكتر (.Helicobacter SPP)

طول این باکتری ۳ و قطر آن حدوداً نیم میکرومتر است. کم هوازی (میکروآئروفیل) است و به وسیله آنزیم هیدروژناز با تجزیه مولکول هیدروژن تولید انرژی می‌کند. مهم‌ترین آنزیم هائی که این باکتری تولید می کند شامل  اکسیداز، کاتالاز و اوره‌آز می‌باشد.

هلیکوباکتر پیلوری باكتری اسپیرالی شکل و گرم منفی است و در لام رنگ آمیزی شده به شکل حرف انگلیسی s دیده می شود. نام قدیمی آن كمپیلوباكتر پیلوری است ولی امروزه به آن هلیكوباكتر پیلوری (Helicobacter pylori) ‌گفته می‌شود. گونه‌های هلیكوباكتر (۲۳ گونه) در حیوانات مختلفی یافت می‌شوند (جدول ۱). بیشتر گونه‌های باكتری در معده ساكن هستند. البته بعضی از گونه‌ها، هم از كبد و هم از معده جدا می‌شوند. تنها چند گونه اوره‌آز منفی در روده وجود دارند. هلیكوباكتر پیلوری عامل گاستریت مزمن فعال در انسان و عامل اصلی زخم معده و زخم دوازدهه است و عامل خطر مهمی در ایجاد آدنوكارسینومای معده و لنفوم‌های با گرید پائین سلول‌های B (لنفوم غیرهوچکین) در بافت لنفوئیدی مخاطی معده است. هلیکوباکتر پیلوری همچنین در ایجاد اسهال، سوء تغذیه، و نارسائی رشد در اطفال دخالت دارد. برای جداسازی هلیکوباکتر پیلوری لازم است نمونه ی بیوپسی گاستریک کشت شود. نمونه‌ی بیوپسی از مخاط آنتر معده (ناحیه‌ی نزدیک به دوازدهه) را در یک شیشه‌ی محتوی نیم میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل قرار داده و در سریع‌ترین زمان ممکن به آزمایشگاه ارسال می‌نمایند.

اختلاف های بین باکتری های گرم مثبت و باکتری های گرم منفی
بخوانید

جدول ۱: گونه‌های هلیکوباکتر و ارگانیسم‌های وابسته به همراه مخازن آن‌ها

گونه‌های هلیکوباکتر و ارگانیسم‌های وابسته به همراه مخازن آن‌ها

به منظور مشاهده‌ی جدول در ابعاد بزرگ، بر روی آن کلیک فرمایید.

هلیكوباكتر پیلوری یک باسیل میكروائروفیلیک با كمی خمیدگی است كه دسته‌ای تاژک غلافدار در یك قطب خود دارد. اگرچه در گذشته این باكتری به‌عنوان گونه‌ای از كمپیلوباكتر در نظر گرفته می شد، اما بر روی Campy BAP آگار قابل كشت نبود، چرا که هلیكوباكتر پیلوری به سفالوتین حساس است. هلیكوباكتر پیلوری بر روی بروسلا آگار، محیط برین هارت اینفیوژن (BHI) یا تریپتكاز سوی آگار حاوی ۵ درصد خون دفیبرینه اسب یا گوسفند و تایر مارتین آگار رشد می‌کند. كلنی‌ها بر روی هر محیط ۳ تا ۶ روز با انكوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد درون جار بی‌هوازی و رطوبت بالا ظاهر می‌شوند. هلیكوباكتر پیلوری در اتمسفر ۱۰ درصد CO2، ۵ درصد O2، ۸۵ درصد N2، یا در هوای حاوی ۱۰ درصد CO2 می‌تواند رشد كند. برای جداسازی اولیه هلیكوباكتر پیلوری، از محیط اسکیرو شامل آنتی‌بیوتیک‌های وانکومایسین، پلی‌میکسین B و تری‌متوپریم و شکلات آگار می‌توان استفاده کرد. هلیكوباكتر پیلوری خاصیت همولیتیك ضعیف دارد، اكسیداز و كاتالاز مثبت است و فعالیت اوره‌آزی بسیار شدیدی دارد. این باکتری با گونه‌های كمپیلوباكتر از نظر پروفایل اسید‌های چرب (درصد بالایی از اسیدچرب ۱۴ و درصد کم اسیدچرب ۱۶ و وجود اسیدچرب: ۱۸ء۳OH) تفاوت دارد.

عوامل مهمی كه در بیماری‌زایی هلیكوباكتر پیلوری دخیل هستند عبارتند از: ادهسین‌ها، اوره‌آز، فلاژل، سیتوتوكسین واكوئله كننده، پروتئین CagA، سوپراكسیداز دیسموتاز، كاتالاز و فسفولیپاز. هلیکوباکتر پیلوری در محیط‌های با pHء ۶ تا ۷ قدرت رشد دارد، بنابراین در لومن معده که pH بین ۱ تا ۲ است قدرت رشد ندارد و از بین می‌رود. بیشترین جایگاه عفونت، آنتروم (نزدیك دوازدهه كه ترشح اسیدی ندارد) است. باكتری می‌تواند تا مدت‌های طولانی (گاهی تا ۳۰ سال یا بیشتر) در این ناحیه وجود داشته باشد. هلیكوباكتر پیلوری به مخاط معده که pH حدود ۷ دارد، تهاجم ندارد، اما محصولاتش به مخاط آسیب می‌رساند. محققین گزارش كرده‌اند كه پروتئین شوك حرارتی (HSP) هلیكوباكتر پیلوری دارای قرابت آنتی‌ژنیكی با میزبان است. بنظر می‌رسد كه این آنتی‌ژن‌های واكنش متقاطع‌دهنده، سبب القاء خودایمنی حاصل از آنتی‌بادی یا پاسخ ایمنی سلولی گردیده و می‌توانند سبب التهاب بسیار طولانی شوند كه ده‌ها سال باقی می‌ماند.

نشان داده شده كه عفونت با هلیكوباكتر پیلوری سبب افزایش ترشح گاسترین و اسیدهای معده می‌شود و این افزایش مقدار اسید معده سبب متاپلازی و افزایش استقرار هلیكوباكتر پیلوری در دوازدهه می‌گردد. وقتی هلیكوباكتر پیلوری در سلول‌های‌ اپی‌تلیال متاپلازی شده، رشد می‌یابد، محصولات آن همزمان به همراه اسیدهای معدی و پاسخ ایمنی، سبب تخریب مخاط و ایجاد التهاب می‌گردند.

هلیكوباكتر پیلوری در مدفوع، ترشحات دهان و پلاک‌های دندانی یافت می‌گردد. به همین علت محققین عقیده دارند كه باكتری علاوه بر روش مدفوع – دهانی به روش دهان به دهان نیز منتقل می‌گردد. مطالعات نشان داده است که حدود ۴۰ درصد بالغین در كشورهای توسعه‌یافته و ۸۰ درصد بالغین در كشورهای در حال توسعه با هلیكوباكتر پیلوری آلوده هستند. با توجه به اینکه عفونت درون فامیلی نیز گزارش شده است، لذا انتقال شخص به شخص نیز ممکن است رخ دهد.

شناسایی باسیل‌های گرم منفی: مروری سریع بر کمپیلوباکتر
بخوانید
کلنی های هلیکوباکتر پیلوری بر روی محیط آگار خوندار با واکنش ضعیف بتاهمولیتیک و رشد در دمای 37 درجه سانتیگراد
کلنی های هلیکوباکتر پیلوری بر روی محیط آگار خوندار با واکنش ضعیف بتاهمولیتیک و رشد در دمای 37 درجه سانتیگراد
باکتری های گرم منفی به شکل s و نیز بشکل اسپیرال
باکتری های گرم منفی به شکل s و نیز بشکل اسپیرال
هلیکوباکتر پیلوری رنگ آمیزی گرم از محیط کشت
هلیکوباکتر پیلوری رنگ آمیزی گرم از محیط کشت

تشخیص آزمایشگاهی

عفونت‌های معده حاصل از هلیكوباكتر پیلوری با کمک روش‌های مختلفی قابل تشخیص هستند كه بیشترین آن‌ها بیوپسی، كشت، تعیین آنتی‌بادی و تست تنفسی اوره هستند. ژن پروب، تکنیک‌های ایمونوفلورسانس و PCR نیز در بعضی از آزمایشگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند، اما هنوز به‌طور معمول استفاده نمی‌شوند. نمونه‌های بیوپسی را برای تست‌های بافت‌شناسی و یا با مخلوط نمودن در سرم فیزیولوژی برای کشت می‌توان استفاده نمود. نمونه خون نیز برای اندازه‌گیری آنتی‌بادی‌های سرمی جمع‌آوری می‌شود. نمونه مدفوع را برای شناسایی آنتی‌ژن‌های هلیكوباكتر پیلوری می‌توان مورد بررسی قرار داد. این تست به‌خصوص برای بررسی تأثیر درمان در افراد آلوده به هلیكوباكتر پیلوری بسیار مناسب است. ارگانیسم را می‌توان با تهیه گستره از نمونه‌های بیوپسی مخاط معده و رنگ‌آمیزی آن‌ها با روش‌های‌ گرم، گیمسا یا نقره و ایمنوهیستوشیمی مشاهده نمود. كشت آن‌ها در محیطی مشابه كمپیلوباكترها انجام می‌شود. لازم به ذکر است که کشت در صورتی که فرد به درمان پاسخ نمی‌دهد برای تعیین حساسیت دارویی بایستی انجام گیرد. وقتی کشت درخواست می‌گردد، نمونه‌ها باید در طی دو ساعت کشت شوند. لازم به یادآوری است که در طی این دو ساعت باید نمونه‌ها در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری گردند. محیط‌های قابل استفاده در انتقال نمونه‌ها شامل آبگوشت بروسلا  حاوی ۲۰ درصد گلسیرول، Cysteine Albemi broth حاوی ۲۰ درصد گلیسرول، سالین ایزوتونیک حاوی ۴ درصد گلوکز و محیط انتقالی استوارت (Stuart’s) است. باکتری را باید در محیطی مانند محیط BHI، کلمبیا آگار با ۱۰ درصد خون گوسفند، اسکیروی، شكلات آگار، بروسلا آگار یا تریپتیكاز سوی آگار حاوی ۵ درصد خون گوسفند، Wilkens Chalgren آگار و سایر محیط‌هایی كه حاوی وانكومایسین، نالیدیكسیک اسید و آمفوتریسین B هستند، كشت داده و در شرایط میكروائروفیلیک در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه کرد. کلنی شفاف، خاکستری و کوچک (به قطر ۲-۱ میلی‌متر) در مدت زمان ۳ تا ۶ روز ظاهر می‌شود. این باكتری برخلاف كمپیلوباكتر ژژونی، نسبت به نالیدیكسیك اسید مقاوم و نسبت به سفالوتین حساس است. هلیكوباكتر پیلوری اكسیداز و كاتالاز مثبت بوده و به‌شدت تولید اوره‌آز می‌كند. لازم به یادآوری است كه كمپیلوباكترها اوره‌آز منفی هستند. در برخی از آزمایشگاه‌ها از سیستم کشت خون اتوماتیک برای جداسازی گونه‌های مختلف هلیکوباکتر استفاده می‌کنند ولی باید توجه داشت که مدت زمان انکوباسیون در این سیستم‌ها برای جداسازی این باکتری‌ها بیش از ۵ روز است.

چند تست آنتی‌بادی برای جستجوی آنتی‌بادی IgG ضد هلیكوباكتر پیلوری در سرم بیمار وجود دارد. این تست‌ها ارزش تشخیصی زیادی ندارند ولی می‌توانند در مطالعات اپیدمیولوژی و نظارتی مفید باشند. در یك مطالعه تست الایزا ۹۳ درصد حساسیت و ۸۱ درصد اختصاصیت برای هلیكوباكتر پیلوری نشان داده است. در مقابل، تست میكروهماگلوتیناسیون ۸۷ درصد حساسیت و ۶۹ درصد اختصاصیت داشته و تست لاتكس آگلوتیناسیون ۷۱ درصد حساسیت و ۷۴ درصد اختصاصیت دارد.

نکته مهم:

• تست‌های سنجش آنتی‌بادی در تشخیص عفونت فعال و یا بعد از درمان کارایی محدودی دارند.

• شناسایی آنتی‌ژن‌ هلیكوباكتر پیلوری در نمونه مدفوع، آزمایشی مناسب برای تعیین كارایی درمان در افراد مبتلا به عفونت هلیكوباكتر پیلوری است.

تست تنفسی اوره (Urease Breath Test (UBT به‌عنوان تست غیرتهاجمی جستجوی هلیكوباكتر پیلوری در معده انجام می‌شود. بیماران، مقداری اوره نشاندار با C13 یا C14 را خورده و اگر هلیكوباكتر پیلوری وجود داشته باشد، باكتری اوره را در معده به CO2 تبدیل می‌کند و در بازدم میزان آن اندازه‌گیری می‌شود. این تست حساسیت و اختصاصیت ۹۵ تا ۱۰۰ درصد دارد، همچنین می‌توان به بیمار اوره نشاندار با N15 داد تا اگر آلوده به این باکتری باشد اوره را تجزیه و آمونیاک و CO2 را آزاد نماید. آمونیاک آزادشده از راه خون وارد ادرار می‌شود و می‌توان میزان آمونیاک نشاندار تولیدی را در ادرار اندازه‌گیری کرد. این تست حساسیت و اختصاصیت معادل ۹۶ تا ۱۰۰ درصد دارد.

امروزه از روش‌های مولکولی به‌خصوص PCR به‌عنوان تکنیک‌هایی با حساسیت بالا برای شناسایی هلیكوباكتر پیلوری در نمونه‌های مختلف استفاده می‌گردد.

درمان

رمز موفقیت درمان ضد هلیكوباكتر پیلوری، استفاده از روش درمان تركیبی است. درمان این عفونت‌ها شبیه درمان مننژیت باكتریایی است. باکتری‌ها در محل حفاظت‌شده‌ای هستند، پس باید از آنتی‌بیوتیک‌های باكتریوسید استفاده كرد و همه باکتری‌ها را حذف نمود. عفونت هلیكوباكتر پیلوری معمولاً با تركیبی از بیسموت سالسیلات، مترونیدازول و آموکسی‌سیلین یا تتراسایكلین درمان می‌شود. بیماران باید دو هفته این داروها را مصرف نموده و هفته‌ها یا ماه‌ها بعد، از جهت هلیكوباكتر پیلوری آزمایش شوند تا اطمینان حاصل شود كه درمان مؤثر بوده است. درمان دیگری كه می‌توان استفاده كرد، تركیب رانیتیدین، بیسموت سیترات و كلاریترومایسین یا تركیب مهارکننده پمپ پروتون و آموكسی‌سیلین و كلاریترومایسین است. اخیراً، مطالعه‌ای نشان داده است كه استفاده از یک مهارکننده پمپ پروتون (امپرازول) به‌تنهایی در درمان هلیكوباكتر پیلوری، خطر ابتلا به گاستریت آتروفیک را بسیار بالا می‌برد. امروزه مقاومت به مترونیدازول و کلاریترومایسین در هلیكوباكتر پیلوری گزارش شده است. برای تعیین حساسیت آنتی‌بیوتیکی، CLSI توصیه می‌کند از محیط مولرهینتون آگار حاوی ۵ درصد خون گوسفند استفاده گردد.

منبع مورد استفاده:

دكتر رضا میرنژاد. مروری تازه بر یرسینیا، کامپیلوباکتر، و هلیکوباکتر. ماهنامه اخبار ازمایشگاهی. شماره ۱۸۵٫ سال ۱۳۹۸

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا