اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی (بخش هشتم)

ترجمه و تنظیم: دکتر محمد قهری

۱۰- کشت نمونه‌ها در پلیت و انکوبه کردن آن‌ها

به‌طور کلی استفاده از محیط‌های کشت در پلیت نسبت به لوله یا ظروف دیگر ارجحیت دارد. محیط‌های کشت داخل پلیت یک سطح بزرگ‌تری را فراهم می‌کنند که در آن حجم بزرگ‌تری از نمونه را می‌توان کشت داد، همچنین تبادل هوا بهتر صورت می‌گیرد و نیز امکان مشاهده‌ی بهتری برای کشت‌های مخلوط و مطالعه و بررسی ویژگی‌های کلنی فراهم می‌آورد (برای اطلاعات بیشتر به بخش ۱۰/۱ مراجعه شود).

لوله‌ها امکان جداسازی قارچ‌های مهم و مورد نظر را به‌مقدار زیادی کاهش می‌دهند، کلنی‌ها به آسانی روی هم را می‌پوشانند و در طول مراحل اولیه‌ی رشد، سطح آگار بسیار مرطوب باقی می‌مانند. به هر حال در صورتی‌ که از لوله‌های شیب‌دار (slant) استفاده می‌شود قطر لوله‌ی کشت باید حداقل ۲ سانتی‌متر باشد برای این‌ که سطح کافی هوا برای رشد فراهم شود. لوله‌های شیب‌دار باید قبل از اینکه نمونه روی آن تلقیح شود رطوبت اضافی سطح آن‌ها گرفته شود. در ابتدا لوله‌های محتوی محیط کشت باید به‌صورت افقی انکوبه شوند (یعنی لوله در وضعیت شیب‌دار خود قرار گیرد) و درب آ‌ن‌ها سست و شل باشد تا تبادل هوایی که برای رشد و اسپورزایی مورد نیاز است به‌خوبی انجام گیرد. هنگامی‌که نمونه‌ی تلقیح شده خشک شد لوله‌هایی که با درب‌هایشان همچنان شل باقی مانده را می‌توان به وضعیت قائم (upright) برگرداند. به‌دلیل اینکه برداشتن درب لوله می‌تواند خطر ایمنی جدی برای پرسنل آزمایشگاه ایجاد نماید، به‌ویژه در مواردی که کپک حضور داشته باشد، درب لوله‌ها هر چند روز یکبار باید چک شوند تا مطمئن شویم که آن‌ها به‌صورت شل (و البته بسته) در جای خود حضور دارند.

۱۰/۱- تلقیح نمونه‌ها در محیط کشت

اغلب آزمایشگاه‌ها از برچسب‌های کامپیوتری برای شناسایی محیط‌های کشت (که در سمت ظرف محتوی آگار چسبانده می‌شود و نه بر روی درب آن) استفاده می‌کنند. با توجه به ظاهر مشابه برخی از این محیط‌های کشت، نام محیط کشت (که نقش بسته شده) نباید زدوده یا محو شود زیرا هنگام خواندن (بررسی) پلیت‌ها دسترسی به این اطلاعات اهمیت دارد. توصیه می‌شود که حداکثر مقدار نمونه بر روی محیط کشت تلقیح شود، در مورد نمونه‌های مایع بهتر است بیش از نیم میلی لیتر تلقیح نشود زیرا این مقدار حداکثر مقدار مایعی است که در سطح محیط کشت آگار می‌تواند جذب شود. باید اجازه داده شود که نمونه‌ی تلقیح شده در جای خود دست نخورده و یکجا بماند تا کاملا خشک شود (آب اضافی آن جذب محیط کشت شود) و سپس کشت خطی (streaking) داده شود. هیچ‌گونه اجماعی برای راه مناسب تلقیح در محیط کشت وجود ندارد اگرچه یک تمرین خوب این است که تلقیح و کشت خطی در نزدیکی لبه‌های پلیت انجام نگیرد (تقریبا یک سانتی‌متر از لبه‌ها فاصله گرفته شود).

گوشه‌های پلیت اغلب می‌تواند به‌وسیله‌ی قارچ‌های هوابرد آلوده شود و دراین‌صورت هنگامی‌که این قارچ‌ها رشد کردند تفسیر کشت را با دشواری مواجه می‌سازند. یکی از روش‌های مناسب تلقیح کردن به مرکز محیط‌های کشت و استفاده از لوپ استریل برای کشت خطی از سمت مرکز به طرف گوشه‌های محیط است، در حالی‌که از کشت در گوشه‌ها خودداری می‌گردد. می‌توان پلیت را چرخانده و مجددا ۲ بار دیگر کشت دادن (streak) را ادامه داد. این روش استریک کردن معکوس کمک می‌کند که مقدار بیشتری ماده‌ی تلقیح شونده در مرکز پلیت و مقدار کم‌تری از آن در نزدیکی گوشه‌ها قرار گیرد و نیز اجازه می‌دهد که آلوده کننده‌ها آسان‌تر مورد شناسایی قرار گیرند. اگر این روش ایزولاسیون کافی را فراهم نکند یک روش تلقیح مشابه که با نمونه‌های باکتریولوژیکال مورد استفاده قرار می‌گیرد ممکن است ترجیح داده شود. بعد از تلقیح پلیت‌ها باید بوسیله‌ی نوار چسب قابل نفوذ به گاز یا نوار سلولوزی بسته (seal) شوند. این عمل از خشک شدن پلیت‌ها جلوگیری می‌کند و نیز از خارج شدن اسپورها یا کنیدی‌ها و آلوده کردن انکوباتور آزمایشگاهی یا ایجاد خطر برای کارکنان آزمایشگاه جلوگیری می‌کند.

علاوه‌بر این بستن یا سیل کردن پلیت‌ها به جلوگیری از آلوده شدن با مایتپ‌ها (به ضمیمه‌ی D برای اطلاعات در مورد کنترل مایت رجوع شود) کمک خواهد کرد. برخی از آزمایشگاه‌ها ترجیح می‌دهند که پلیت‌ها را داخل کیسه‌های پلاستیکی بسته نگهداری کنند و یا ظروف ثانویه‌ی دیگری که باید برای جلوگیری از آلودگی تعویض یا ضدعفونی شوند. پلیت‌ها باید در حالتی که سمت آگار پایین است نگهداری (انکوبه) شوند.

۱۰/۱/۱- نمونه‌های جامد (مانند بافت، مو، ناخن، و پوست)

نمونه‌های ریزریز شده (minced) و یا هموژنیزه شده (بخش ۸/۳ را مشاهده کنید)، تراشه‌های پوست و ناخن، و قطعات مو باید در سطح آگار کاشته شوند (با خراشیدن محیط کشت) این عمل موجب می‌شود که شیب ضروری فشار اکسیژن که می‌تواند به شروع رشد ارگانیسم قارچی موجود در نمونه کمک کند، فراهم شود.

۱۰/۱/۲- نمونه‌های آبگون (مانند مایعات و ادرار)

برای نمونه‌های مایع و آبکی توصیه می‌شود ۰/۲۵ الی ۰/۵ میلی لیتر – تا جایی‌که مقدار نمونه‌ی دریافت شده اجازه می‌دهد – از نمونه بر روی سطح آگار قرار گیرد. سطح آگار را هنگام تلقیح به آرامی خراش دهید و اجازه دهید که نمونه قبل از استریک کردن خشک شود (آب اضافی آن جذب آگار گردد)، سپس نمونه‌ی کشت داده شده را انکوبه نمایید.

۱۰/۱/۳- نمونه‌ی خون جمع آوری شده به‌وسیله‌ی لوله‌های لیز – سانتریفیوژ

نمونه‌های خون بر طبق توصیه‌های سازندگان و شرکت‌ها نیاز به تلقیح دارند. نسبت مناسب تلقیح به آگار مهم است زیرا مقدار اضافه‌ی تلقیح می‌تواند پلیت‌ها را بسیار مرطوب نموده و از نفوذ و انتشار کافی ماده‌ی تلقیح شده به محیط آگار بکاهد. به همین دلیل سازندگان توصیه می‌کنند که از ۴ پلیت استفاده شود. همچنین می‌توانید به بخش ۱۰/۲/۴ رجوع نمایید.

۱۰/۲- محیط‌های کشت

در این بخش فقط در مورد بازیابی (recovery) قارچ‌ها بحث می‌شود. محیط‌های کشت برای جداسازی قارچ‌ها در قارچ شناسی کلینیکی، عموما در یکی از ۴ گروه زیر قرار می‌گیرند:

۱۰/۲/۱- گروه A: محیط‌های کشت عمومی بدون سیکلوهگزامید

به‌عنوان محیط‌های کشت کارآمد برای جداسازی قارچ‌های پاتوژن شناخته شده‌اند.

1. محیط SDA Emmons: محیط اصلاح شده‌ی امونس حاوی ۲% گلوکز است و pH آن نسبت به فرمولاسیون اصلی محیط SDA خنثی‌تر است.
   کلرامفنیکل (۴۰mg/l)، پنی سیلین، استرپتومایسین، و جنتامیسین را به‌عنوان عوامل آنتی باکتریال می‌توان به محیط کشت اضافه کرد (برای سرکوب کردن رشد برخی از گونه‌های باکتریال ممکن است سایر آنتی باکتریال‌ها مورد نیاز باشد).
2. محیط IMA: این یک محیط غنی شده است که حاوی ۱۲۵mg/l کلرامفنیکل است اما همچنین می‌تواند با جنتامیسین (۵۰mg/l) و کلرامفنیکل فرموله شود و یا به‌کمک کلرامفنیکل و سیپروفلوکساسین ساخته شود.

۱۰/۲/۲- گروه B: محیط‌های کشت عمومی با سیکلوهگزامید

سیکلوهگزامید از رشد قارچ‌های ساپروفیت با رشد سریع جلوگیری می‌کند. قارچ‌های پاتوژن با رشد آهسته شامل درماتوفیت‌ها، قارچ‌های دیمورفیک خاص، و قارچ‌های اندمیک (مثل گونه‌های هیستوپلاسما، بلاستومایسس درماتیتیدیس، گونه‌های کوکسیدیوئیدس، و پاراکوکسیدیوئیدس برازیلینسیس) می‌باشند.

این آنتی بیوتیک نمی‌تواند در تمام محیط‌های کشت جداسازی وجود داشته باشد زیرا رشد برخی از پاتوژن‌ها و یا قارچ‌های بالقوه پاتوژن مثل کریپتوکوکوس نئوفرمنس، کریپتوکوکوس گتی، گونه‌های آسپرجیلوس، Scedosporium prolificans و Neoscytalidium dimidiatum و بسیاری از گونه‌های کاندیدا و اکثر قارچ‌های موکوراسئوس را مهار می‌کند.

1.  محیط SDA امونس با سیکلوهگزامید (۵۰۰mg/l) و کلرامفنیکل (۵۰mg/l):
   غلظت سیکلوهزامید در منابع مختلف بین ۱۰۰ تا ۵۰۰ میلی گرم در لیتر ذکر شده است و مقدار معمول آن همان ۵۰۰mg/l است.
2. محیط PFA با ۱% گلوکز، کلرامفنیکل (۵۰mg/l) و سیکلوهگزامید (۵۰۰mg/l):
   این یک محیط ایزولاسیون/ شناسایی مفید و کارآمد است زیرا اسپورولاسیون کپک‌ها را تحریک می‌کند.

۱۰/۲/۳- گروه C: محیط‌های کشت غنی شده

محیط‌های غنی شده برای بهبود بازیابی قارچ‌های دیمورفیک و یا سایر قارچ‌های سختگیر بکار گرفته می‌شوند. ممکن است جلوی کنیدی زایی گرفته شود و بنابراین نیاز به کشت مجدد بر روی محیط‌های کشت دیگر خواهد بود.

• آگار BHI (با یا بدون ۵ تا ۱۰ درصد خون گوسفند) با کلرامفنیکل (۵۰mg/l) و جنتامیسین (۵۰mg/l)

• آگار SABHI با کلرامفنیکل (۵۰mg/l) و جنتامیسین (۵۰mg/l)

۱۰/۲/۴- گروه D: محیط‌های کشت اختصاصی

برای برخی از نمونه ها محیط های کشت غیر از آنچه که در بالا ذکر شد ممکن است مفید باشد.

۱- آگار کروموژنیک: محیط های افتراقی برای جداسازی و شناسایی فرضی برخی گونه های کاندیدا می باشند.

۲- محیط‌های کشت برای بازیابی گونه‌های مالاسزیا: چندین نوع از محیط‌های کشت برای کشت گونه‌های مالاسزیا می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند. اگر از نواحی غیراستریل کشت انجام می‌شود لازم است کلرامفنیکل و سیکلوهگزامید (۵۰۰mg/l) به محیط کشت اضافه شود. pachydermatis تنها گونه از جنس مالاسزیا است که برای رشد خود به لیپید و یا مکمل polysorbate نیاز ندارد.

محیط SDA یا SDA امونس با روغن زیتون که بر روی محیط قرار گرفته به‌وسیله بسیاری از آزمایشگاه‌ها  برای جداسازی گونه‌های وابسته به لیپید مالاسزیا استفاده شده است. اگرچه فقط مالاسزیا فورفور، مالاسزیا پکی درماتیس، و M.yamatoensis به‌خوبی بر روی این محیط‌ها رشد می‌کنند.

به‌دلیل اینکه گونه‌های دیگر در ایجاد بیماری‌های انسانی دخالت دارند محیط‌های پیچیده‌ی دیگر مثل محیط اصلاح شده‌ی Dixon’s و محیط Leeming-notman پیشنهاد شده‌اند.

۳- محیط PFA بدون سیکلوهگزامید: این یک محیط موثر برای جداسازی/ شناسایی است زیرا کنیدی زایی کپک‌ها را تحریک می‌کند. کپک‌هایی که می‌توانند برای تصمصم گیری‌های درمانی در بیماران با عفونت‌های ناشی از قارچ‌های رشته‌ای تهدید کننده‌ی حیات مهم باشند (مانند بیماران پیوند مغز استخوان).

۴- محیط‌های کشت خون: سیستم‌های کشت خون که برای نشان دادن فونژمی مورد استفاده قرار می‌گیرند در زیر لیست شده‌اند:

ظروف کشت خون اختصاصی برای مایکولوژی: این محیط‌ها برای حمایت از رشد مخمرها و کپک‌ها فرموله شده‌اند. شرکت‌های سازنده مدیفیکاسیون متنوعی بر روی آن‌ها انجام داده‌اند. این ظروف ممکن است حاوی یک محیط کشت مثل آبگوشت BHI که با سیترات آمونیوم فریک به‌عنوان منبع آهن، ساپونین برای لیز گلبول‌های قرمز، و قندها و پروتئین‌های ویژه‌ای برای فراهم کردن مکمل‌های تغذیه‌ای باشند. استفاده از محیط‌های کشت اختصاصی قارچی بستگی دارد به تجهیزات هر موسسه، جمعیت بیماران، و بیماری‌های قارچی آندمیک احتمالی در آن منطقه.

استفاده از ظروف کشت خون اختصاصی قارچی زمان آشکارسازی را نسبت به ظروف کشت خون استاندارد باکتریال کوتاه‌تر می‌کند.

سیستم لیز – سانتریفیوژ: کپک‌های دیمورفیک می‌توانند بسیار سریع و با اطمینان در سیستم لیز – سانتریفیوژ بازیابی شوند. برای بازیابی مطلوب ماده‌ی تغلیظ شده می‌تواند به یکی از هرکدام از محیط‌های گروه‌های A و C تلقیح شوند. برخی آزمایشگاه‌ها محیط ژلوز شکلاتی را برای بازیابی قارچ‌ها و باکتری‌های هوازی اضافه می‌کنند.

ظروف کشت خون باکتریال استاندارد: این محیط‌ها برای بازیابی گونه‌های کاندیدا و برخی کپک‌ها مفید هستند. در برخی مطالعات استفاده از فاکتورهایی که عوامل آنتی باکتریال را غیرفعال می‌کنند بازیابی و زمان آشکارسازی مخمرها را بهبود می‌دهند.

محیط‌های کشت اضافی دیگر در ضمیمه‌ی E لیست شده است.

۱۰/۳- انتخاب محیط‌های کشت

تعداد و تنوع محیط‌های کشت که در آزمایشگاه قارچ شناسی مورد نیاز است بر حسب نوع و منبع مواد کلینیکی که به آنجا ارجاع می‌شود بستگی خواهد داشت. استفاده از ۲ یا ۳ محیط کشت برای بازیابی قارچ‌ها از اکثریت نمونه‌های کلینیکال معمولا کفایت می‌کند. انتخاب‌های زیر توصیه می‌شوند:

• برای نمونه‌های غیراستریل و منابع غیردرماتولوژیکال یکی از محیط‌های هرکدام از گروه‌های Aء،B، و C را که در بخش ۱۰/۲ لیست شد، انتخاب کنید.
• برای نمونه‌هایی که به‌طور نرمال استریل هستند یک محیط از هرکدام از گروه‌های A و C را انتخاب کنید.
• برای نمونه‌های درماتولوژیکال یک محیط از هرکدام از گروه‌های A و B را انتخاب کنید.
• محیط‌های گروه D می‌توانند به‌عنوان تنها محیط‌های کشت برای جداسازی/ یا شناسایی فرضی مورد استفاده قرار گیرند. انتخاب‌ها از گروه‌های A تا C را بر حسب طبیعت کار و روش‌هایی که در آزمایشگاه‌های مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرد بکار گرفت.

۱۰/۴- شرایط و الزامات موردنیاز برای انکوباسیون

۱۰/۴/۱- رطوبت و دما

انکوباتورها در دمای ۲±۳۰ تنظیم می‌شوند و این دمای مطلوبی برای بازیابی کردن قارچ‌ها از نمونه‌های کلینیکال است. همچنین باید از رطوبت کافی کسب اطمینان گردد که از خشک شدن پلیت‌های کشت شده جلوگیری شود. انکوبه کردن همزمان نمونه‌ها در دمای ۳۰ درجه و ۳۷ درجه توصیه نمی‌شود. باید توجه داشت که انکوباسیون در ۳۷ درجه ممکن است برخی از عوامل آنتی باکتریال را که در محیط‌های انتخابی وجود دارد غیرفعال کند و نیز موجب شود که برخی از قارچ‌ها که در حالت نرمال نسبت به این عوامل حساس نیستند، حساس شوند. انکوباسیون در دمای اتاق موجب رشد آهسته‌تر مربوط به اختلاف دمای شب و روز می‌شود و به‌دنبال آن ممکن است بازیابی برخی قارچ‌ها را به تاخیر اندازد. آگارهای کروموژنیک برای جداسازی مخمرهای  غیراز کریپتوکوک، و ظروف کشت خون در سیستم‌های اتوماتیک باید مطابق با توصیه‌های شرکت‌های سازنده‌ی آن‌ها انکوبه شوند. محیط‌های کشت برای جداسازی مالاسزیا به‌طور مطلوب در دمای ۱±۳۳ درجه‌ی سانتیگراد انکوبه می‌شوند اگرچه در دمای ۱±۳۰ نیز کافی است.

۱۰/۴/۲- مدت زمان انکوباسیون

کشت‌های درون پلیت‌ها به استثنای آنچه که در زیر نشان داده شده است باید برای ۳ هفته انکوبه شوند. استثناهای مربوط به این توصیه در زیر لیست شده‌اند:

• اگر قارچ‌های دیمورفیک و یا درماتوفیت‌ها مطرح (مورد تردید) باشند انکوباسیون باید برای مدت ۴ هفته ادامه داشته باشد.
• برای نمونه‌های مربوط به دستگاه تنفسی، خون، و مغز استخوان در نواحی اندمیک برای گونه‌های هیستوپلاسما انکوباسیون به‌مدت ۴ هفته دارای اهمیت ویژه است. علاوه براین انکوباسیون ۴ هفته‌ای ممکن است برای نمونه‌هایی که از بیماران HIV/AIDS گرفته می‌شود مناسب باشد. به‌طور کلی بازیابی یک قارچ دیمورفیک در کشت قویا تحت تاثیر بار (load) قارچی در نمونه‌ی کلینیکی قرار می‌گیرد. به‌ عنوان مثال بلاستومایسس درماتیتیدیس در مدت ۲ روز انکوباسیون در محیط کشت بازیابی شده است.
• آگارهای کروموژنیک برای فقط مخمرها (دستگاه تنفسی فوقانی و نواحی اوروژنیتال) باید طبق توصیه‌ی سازندگان آن‌ها انکوبه شوند.
• کشت‌های مخمرها (شامل گونه‌های کریپتوکوکوس نمی باشد) که به‌جای آگارهای کروموژنیک در آگارهای معمولی کشت شده‌اند باید به‌مدت ۷ روز انکوبه شوند.
• افزودن به زمان انکوباسیون باید برای کشت‌های قارچی که از نواحی تنفسی بیماران سیستیک فیبروزیس گرفته می‌شود در نظر گرفته شود. این عمل برای بهبود جداسازی E.dermatitidis در این دسته از بیماران توصیه شده است.
• نمونه‌های درماتولوژیکال برای گونه‌های مالاسزیا باید برای حداقل ۲ هفته انکوبه شوند.
• کشت‌های خون:
• ظروف کشت خون استاندارد در سیستم‌های اتوماتیک: توصیه‌ی سازندگان رعایت شود (عموما ۵ روز).
• ظروف کشت خون مایکولوژیکال در سیستم‌های اتوماتیک: توصیه‌ی سازندگان رعایت شود (عموما ۳ تا ۴ هفته.)
• سیستم‌های لیز – سانتریفیوژ: پلیت‌ها را برای ۳ تا ۴ هفته انکوبه کنید. اگر هیستوپلاسما کپسولاتوم قویا مورد تردید باشد زمان انکوباسیون را باید طولانی‌تر کرد.
• به سایر محیط‌های کشت که در ضمیمه‌ی E لیست شده‌اند برای توصیه‌های مربوط به دمای اختصاصی و مدت زمان انکوباسیون رجوع کنید.