تشخیص کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی

تشخیص کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی اهمیت زیادی دارد. زیرا یکی از شایع‌ترین علل مسمومیت غذایی در جهان محسوب می‌شود. این باکتری در گوشت خام، گوشت طیور، روده حیوانات و به طور کلی در محیط زندگی افراد وجود دارد. ممکن است هر فردی را بیمار کند. اغلب نیز باعث بروز اسهال می‌شود.

مسمومیت ناشی از کلستریدیوم پرفرنجنس (Clostridium perfringens) در مکان‌هایی اتفاق می‌افتد که به گروه‌های بزرگی از مردم خدمات می‌دهند. مانند بیمارستان‌ها، بوفه‌ی مدارس، زندان‌ها و خانه‌های سالمندان.  به همین دلیل جلوگیری از آلوده شدن مواد غذایی به این باکتری اهمیت زیادی دارد.

در این مطلب قصد داریم نحوه تشخیص کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی را توضیح دهیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

این مطالب به استناد از سایت سازمان غذا و دارو (FDA) ارائه شده‌اند.

کلستریدیوم پرفرنجنس چیست و چه بیماری‌هایی ایجاد می‌کند؟

 کلستریدیوم پرفرنجنس قبلاً با نام C. welchii یا Bacillus welchii نیز شناخته می‌شد. این باکتری، بیماری‌زا، گرم مثبت، میله‌ای شکل، بی‌هوازی و اسپورساز است. کلستریدیوم پرفرنجنس به طور طبیعی در طبیعت وجود دارد. این باکتری را می‌توان به عنوان یک جزء طبیعی از پوشش گیاهی در حال پوسیدگی، رسوبات دریایی، روده انسان و سایر مهره داران، بدن حشرات و حتی در خاک یافت.

اکثر افراد مبتلا به عفونت C. perfringens معمولاً ۸ تا ۱۵ ساعت پس از مصرف غذای آلوده دچار علائم می‌شوند. علائم شامل کرامپ‌های (گرفتگی) شدید شکمی، گاز معده و اسهال است.

این بیماری معمولاً به طور ناگهانی شروع می‌شود. اسهال ناشی از عفونت می‌تواند باعث کم آبی بدن گردد و عوارضی جدی را به دنبال داشته باشد.

هر شخصی ممکن است به عفونت C. perfringens دچار شود. اما کودکان خردسال و افراد مسن بیشتر در معرض خطر عوارض جانبی این عفونت قرار دارند.

کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی

مسمومیت کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی زمانی اتفاق می‌افتد که مواد غذایی به خوبی روی حرارت پخته نشوند. یا به اندازه کافی در فریزر سرد نشوند.  

لازم به ذکر است که کلستریدیوم پرفرنجنس هاگ زا است. هاگ در برخی از سویه‌ها حتی در دمای بالای ۱۰۰ درجه سانتیگراد نیز مقاوم است. بنابراین حضور کلستریدیوم پرفرنجنس در غذاها ممکن است اجتناب ناپذیر باشد.

می‌توان گفت که وجود تعداد کمی از C. perfringens در گوشت خام، مرغ، سوپ‌ها و سس‌های کم آب، سبزیجات خام و ادویه‌ها غیر معمول نیست.

اما اگر طبق شواهد بالینی و اپیدمیولوژیک، C. perfringens علت شیوع مسمومیت غذایی باشد، به این معنا است که صدها هزار یا بیشتر از این موجودات در هر گرم از غذا، وجود دارد.

علت آلودگی کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی چیست؟

همانطور که گفته شد، این باکتری هاگ زا است. در واقع هاگ، علت اصلی آلودگی کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی است. هاگ‌ها ممکن است به دلیل شرایط زیر در مواد غذایی باقی مانده و رشد کنند:

۱. غذا به اندازه کافی پخته نشود. هاگ کلستریدیوم پرفرنجنس می‌تواند در دمای بالای ۱۰۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۱ ساعت زنده بماند. اگر زمان پخت مواد غذایی مانند گوشت کافی نباشد. هاگ در ماده غذایی باقی می‌ماند. به محض مهیا شدن شرایط رشد کرده و باعث آلودگی می‌شود.

۲. غذا به اندازه کافی سرد نشود. سلول‌های perfringens در دمای انجماد، از بین می‌روند. به همین دلیل توصیه می‌شود مواد غذایی را در فریزر نگهداری کنید.

۳. کاهش سطح اکسیژن حین پخت و پز. سطح اکسیژن ممکن است در طول پخت به اندازه‌ای کاهش یابد تا امکان رشد کلستریدیا فراهم شود. اگر غذا پس از پخت در یخچال نگهداری نشود، هاگ‌ها جوانه زده و به سرعت رشد می‌کنند.

نحوه تشخیص کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی

تشخیص کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی شامل چندین مرحله است. در ادامه به بررسی این مراحل خواهیم پرداخت.

جمع‌آوری نمونه

• از قسمت‌های مختلف غذای مشکوک نمونه‌های ۲۵ گرمی بردارید. زیرا آلودگی ممکن است به طور نابرابر توزیع شود.
• در صورت امکان، نمونه‌ها را فوراً و بدون انجماد بررسی کنید. نمونه را تا زمان بررسی در دمای حدود ۱۰ درجه سانتی‌گراد نگهداری کنید.
• اگر نمی‌توان آنالیز را در عرض ۸ ساعت شروع کرد، نمونه را به محلول بافر نمک گلیسیرین استریل آغشته کنید. سپس بلافاصله در دمای ۷۰- تا ۹۰- درجه فارنهایت (۵۶ – الی ۶۷- درجه سانتی گراد) فریز کرده و به آزمایشگاه ارسال کنید.

نحوه استفاده از بافر

• از تکنیک آسپتیک برای آماده سازی نمونه استفاده کنید.
• ۲۵ گرم از نمونه (گوشت برش داده شده، بوقلمون و غیره) را به ظرف استریل ۱۵۰ میلی لیتری منتقل کنید.
• ۲۵ میلی لیتر محلول بافر گلیسیرین نمک اضافه کنید.
• هوا را از کیسه خارج کنید و نمونه را با محلول گلیسیرین خوب مخلوط کنید.
• نمونه‌های مایع مانند آب‌میوه یا آب گوشت گاو را باید با حجم مساوی از محلول بافر گلیسیرین – نمک با قدرت مضاعف مخلوط کرد.
• نمونه را بلافاصله در دمای ۷۰- تا ۹۰- درجه فارنهایت در فریزر با دمای پایین نگهداری کنید تا انجماد در سریع ترین زمان ممکن رخ دهد.
• نمونه‌‌ها را تا زمان بررسی در این دما نگهداری کنید.
• حین بررسی، نمونه‌ها را در دمای اتاق ذوب کنید. ۲۰۰ میلی لیتر مایع رقیق کننده پپتون را به ظرف اضافه کنید و به بررسی ادامه دهید.
• اگر نمونه باید به آزمایشگاه ارسال شود، مراحل بالا را دنبال کنید و نمونه یخ زده را در تماس با یخ خشک بسته بندی کنید. تا درجه حرارت تا حد امکان در طول حمل و نقل حفظ شود.
• نمونه را در ظرفی قرار دهید که در برابر گاز CO غیرقابل نفوذ است. جذب CO2 توسط نمونه می‌تواند pH را کاهش دهد.
• کاهش pH منجر به مرگ C. perfringens می‌گردد.
• نمونه را هنگام تحویل در دمای ۷۰ – تا ۹۰ – درجه فارنهایت نگهداری کنید .

استفاده از محیط کشت برای شمارش کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی

برای بررسی کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی از محیط کشت‌های مختلفی استفاده می‌شود. اما مرحله اول جهت بررسی نمونه، رنگ‌آمیزی گرم است.

کلستریدیوم پرفرنجنس میله‌ای شکل و گرم مثبت است.

۱. تهیه پلیت برای کلستریدیوم پرفرنجنس زنده درمواد غذایی

برای بررسی کلستریدیوم پرفرنجنس زنده درمواد غذایی ممکن است از محیط کشت‌ها و روش‌های مختلفی استفاده شود. در ادامه یکی از این روش‌ها را مورد بررسی قرار خواهیم داد.

• با استفاده از روش آسپتیک، ۲۵ گرم نمونه غذا را در ظرف استریل بریزید.
• ۲۲۵ میلی لیتر مایع رقیق پپتون (رقت ۱:۱۰) را به آن اضافه کنید.
• مواد را به مدت ۱ الی ۲ دقیقه با سرعت کم روی همزن قرار دهید.
• از محلول آماده شده، رقت های سریالی تهیه کنید. برای آشنایی با نحوه تهیه رقت سریالی می‌توانید به مقاله ” تهیه‌ی رقت‌های سریالی ” مراجعه کنید.
• ۶ الی۷ میلی لیتر آگار TSC (بدون زرده تخم مرغ) را درون پتری دیش بریزید.
• با چرخاندن سریع ظرف، آگار را به طور یکنواخت در کف ظرف پخش کنید.
• ۱۰ ظرف را به این ترتیب آماده کنید.
• هنگامی که آگار جامد شد، پلیت‌ها را برچسب گذاری کنید.
• رقت‌های آماده شده را به آرامی تکان دهید تا مخلوط شود. سپس ۱ میلی لیتر از هر رقت هموژن را در مرکز آگار بریزید.
• در نهایت ۱۵ میلی لیتر دیگر از آگار TSC (بدون زرده تخم مرغ) را در ظرف بریزید. ظرف را به ارامی بچرخانید تا آگار با رقت ریخته شده در ظرف مخلوط شود.

۲. تست تایید احتمالی

• از پلیت‌های کشت داده شده، ۱۰ کلنی را انتخاب کنید.
• تیوگلیکولات براث مایع، تازه و خنک شده را درون لوله‌های آزمایش بریزید.
• هر کلنی را درون یکی از این لوله های آزمایش تلقیح کنید.
• سپس لوله‌ها را در به مدت ۱۸ الی۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.
• با استفاده از رنگ‌آمیزی گرم، خلوص هر کشت را بررسی کنید.
• perfringens یک باسیل کوتاه، ضخیم و گرم مثبت است. اگر شواهدی از آلودگی وجود داشت، کشت(های) آلوده را روی آگار TSC (حاوی زرده تخم مرغ) قرار دهید و در شیشه بی‌هوازی به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتی‌گراد انکوبه کنید.
• کلنی‌های سطحی کلستریدیوم پرفرنجنس خاکستری مایل به زرد با مناطق مات ۲ الی۴ میلی متری ناشی از فعالیت لسیتیناز هستند.

۳. آزمون فرضی Iron-milk برای تشخیص کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی

• محیط کشت Iron-milk اصلاح شده را با ۱ میلی‌لیتر کشت تیوگلیکولات مایع در حال رشد فعال تلقیح کنید.
• از لوله‌های کوتاه برای آزمایش استفاده نکنید. زیرا انعقاد شیر ممکن است سبب سرریز شدن نمونه در حمام آب شود.
• محیط را در دمای ۴۶ درجه سانتی گراد در حمام آب انکوبه کنید.
• پس از ۲ ساعت، کشت را هر ۱ ساعت از نظر “تخمیر طوفانی^[۱]” بررسی کنید.
• این واکنش با انعقاد سریع شیر و به دنبال آن ایجاد توده اسفنجی مشخص می‌شود. کشت هایی که نتوانند “تخمیر طوفانی” را در عرض ۵ ساعت نشان دهند، اغلب حاوی perfringens نیستند.
• اگر واکنش پس از ۶ ساعت یا بیشتر اتفاق افتاد، نتیجه مشکوک است و باید با آزمایش‌های بیشتر تأیید شود.
• سرعت “تخمیر طوفانی” به سویه و جمعیت اولیه بستگی دارد. بنابراین، فقط کشت‌های فعال و در حال رشد برای این آزمایش مناسب هستند.

لازم به ذکر است که برخی از سویه‌های C. baratii به این روش واکنش نشان می‌دهند. اما این گونه را می‌توان با استفاده از محیط لاکتوز-ژلاتین متمایز کرد.

۴. تست تاییدی برای تشخیص کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی

برای انجام این تست از دو محیط کشت motility-nitrate (بافر شده) و لاکتوز-ژلاتین استفاده می‌شوند.

با استفاده از لوپ (۲ میلی متری) نمونه‌ی موجود در محیط تیوگلیکولات براث را درون هر دو محیط کشت ذکر شده تلقیح کنید. می‌توان از کلنی جدا شده از پلیت TSC آگار نیز استفاده کرد.

الف/ لاکتوز-ژلاتین

• برای اطمینان از تلقیح کافی، لوپ را چندین بار در لاکتوز-ژلاتین فرو ببرید.
• محیط تلقیح شده را ۲۴ ساعت در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه کنید.
• کشت‌ها از نظر تولید گاز و تغییر رنگ از قرمز به زرد (که نشان دهنده تولید اسید است) بررسی کنید.
• لوله‌ها را به مدت ۱ ساعت در دمای ۵ درجه سانتیگراد سرد کنید. سپس آن را از نظر مایع شدن ژلاتین بررسی کنید. اگر حالت ژلاتینی متوسط بود، ۲۴ ساعت دیگر در دمای ۳۵ درجه سانتیگراد انکوبه کنید و مایع شدن ژلاتین را بررسی کنید.

ب/ motility-nitrate

لوله‌های حاوی محیط motility-nitrate را از نظر نوع رشد در امتداد خط تلقیح بررسی کنید. موجودات غیر متحرک فقط در داخل و در طول خط رشد می‌کنند. ارگانیسم‌های متحرک معمولاً رشد پراکنده‌ای را در محیط کشت ایجاد می‌کنند.

۵. بررسی نتایج

‌نتایج آزمایشات فوق را در یک جدول ثبت کنید.

• perfringens یک باسیل گرم مثبت غیر متحرک است.
• در TSC آگار کلنی‌های سیاه تولید می‌کند.
• نیترات‌ها را به نیتریت‌ها کاهش می‌دهد.
• در محیط حاوی لاکتوز، اسید و گاز تولید می‌کند.
• ژلاتین را ظرف ۴۸ ساعت مایع می‌کند.

برخی از سویه‌های C. perfringens اسپورزایی ضعیفی در محیط اسپورزایی نشان می‌دهند. ارگانیسم‌های مشکوک به C. perfringens که معیارهای ذکر شده را برآورده نمی‌کنند برای تایید، نیاز به آزمایش اضافی دارند.

سخن پایانی

بررسی کلستریدیوم پرفرنجنس در صنایع غذایی یکی از آزمایشات رایج است. غذاهای حاوی این میکروارگانیسم می‎توانند مسمومیت‌های خفیف تا شدید را در افراد مختلف ایجاد کنند. به طور کلی مسمومیت در اثر کلستریدیوم پرفرنجنس یکی از بیماری‌های رایج در سراسر جهان محسوب می‌شود. به همین دلیل نحوه بررسی آن در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی و صنایع غذایی اهمیت زیادی دارد. در این مطلب سعی کردیم آزمایشات رایج برای بررسی  کلستریدیوم پرفرنجنس در مواد غذایی را بیان کنیم. لازم به ذکر است که هر آزمایشگاهی بسته به قوانین کشور و بومی خود ممکن است از آزمایش‌های متفاوتی استفاده کند.

آیا شما تا به حال این آزمایش را انجام داده‌اید؟ از چه روش‌های دیگری استفاده کرده‌اید؟

واژه نامه