آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول ، چگونه با دشمن نامرئی مقابله کنیم؟

آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول یکی از معضلات اصلی در آزمایشگاه‌های کشت سلولی به شمار می‌رود. این آلودگی می‌تواند به‌طور قابل توجهی بر فیزیولوژی و متابولیسم سلول‌ها تاثیر بگذارد.

از آنجایی که امروزه کشت سلول اهمیت بالایی در حوزه‌های تحقیقاتی و سلول درمانی دارد، نگرانی‌های بیشتری در  مورد آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول مطرح است.

به همین در دلیل در این مقاله قصد داریم به بررسی آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلول و راهکارهای تشخیص و جلوگیری از آن بپردازیم. پس در ادامه با ما همراه باشید.

آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول

همانطور که در قسمت مقدمه گفته شد، کاربرد سلول‌ها در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی، پزشکی و بیوتکنولوژیک به‌طور گسترده‌ای در حال رشد است. همچنین پیش‌بینی می‌شود که با توجه به محدودیت استفاده از حیوانات آزمایشگاهی توسط قوانین حمایت از حیوانات، استفاده از کشت سلولی در آینده افزایش خواهد یافت. برای دستیابی به نتایج قابل تکرار، شرایط کشت سلولی مناسب، حیاتی است. کشت سلول در آزمایشگاه می‌تواند توسط باکتری‌ها و یا قارچ‌های مختلف آلوده شود. اما این نوع آلودگی در اغلب موارد به‌راحتی قابل تشخیص است. بنابراین به‌ندرت سبب خطا در نتایج می‌گردد.

اما معضل اصلی، آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول است. مایکوپلاسما فاقد دیواره سلولی است و به سطح سلول‌ می‌چسبد. به‌همین دلیل دشمن نامرئی کشت‌های سلولی به شمار می‌رود. علاوه براین، مایکوپلاسماها نسبت به اغلب آنتی‌بیوتیک‌های رایج مقاوم هستند و از بین بردن آن‌ها در کشت سلولی دشوار است.

استفاده از سلول‌های آلوده تقریباً تمام جنبه‌های فیزیولوژی سلولی را به خطر می‌اندازد و اغلب منجر به نتایج اشتباه یا از بین رفتن رده‌های سلولی می‌شود. همچنین از آنجایی که تشخیص آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول دشوار است، ممکن است محصول نهایی (مانند واکسن) آلوده شده و عواقب جبران‌ناپذیر زیادی را به دنبال داشته باشد.

بنابراین، استفاده از روش‌های تشخیص کارآمد برای بررسی آلودگی مایکوپلاسما از اهمیت زیادی برخوردار است.

 بررسی مایکوپلاسما معمولاً با روش‌های تشخیص مستقیم و غیرمستقیم انجام می‌شود. روش مستقیم از طریق بررسی میزان رشد کلنی مایکوپلاسما در آگار صورت می‌گیرد. روش غیرمستقیم از طریق بررسی و سنجش محصولات ژنی تولیده شده توسط مایکوپلاسما انجام می‌شود. استفاده از تکنیک‌های رنگ‌آمیزی نیز یکی از روش‌هایی است که در کشت‌های مشکوک به آلودگی مایکوپلاسمایی صورت می‌گیرد.

مایکوپلاسما چیست؟

در قسمت قبل سعی کردیم مروری اجمالی بر آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول داشته باشیم. اما پیش از اینکه به بررسی بیشتر این موضوع بپردازیم، لازم است ابتدا با مایکوپلاسما آشنا باشیم.

مایکوپلاسما نوعی باکتری است. یکی از تفاوت‌های مایکوپلاسما با سایر باکتری‌ها عدم وجود دیواره سلولی است که باعث ایجاد غشای انعطاف‌پذیر مایکوپلاسما می‌شود. این غشاء انعطاف‌پذیر، مایکوپلاسما را قادر می‌سازد تا اشکال مختلفی به خود گرفته و بنابراین زیر میکروسکوپ‌های پرقدرت نیز به سختی شناسایی شود.

 اندازه کوچک مایکوپلاسما (۰/۱۵-۰/۳ میکرومتر) نیز یکی از دلیل اصلی فرار آن‌ها از سیستم‌های فیلترینگ و رشد آن‌ها در کشت سلولی است، بدون اینکه کدورت یا علائم آشکاری از آلودگی ایجاد کنند.

آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول از چه طریق اتفاق می‌افتد؟

مایکوپلاسماها می‌توانند با استفاده از اندامک‌های مخصوص خود به سلول‌های میزبان متصل شوند. این اندامک‌ها چسبندگی بالایی دارند تا به سلول‌های یوکاریوتی بچسبند و به سلول میزبان نفوذ کنند. فقدان دیواره سلولی در مایکوپلاسما ممکن است به ترکیب شدن آن با غشای سلول میزبان و تبادل غشاء و اجزای سیتوپلاسمی کمک کند. در ادامه علل بروز آلودگی مایکوپلاسمایی در کشت سلول را مورد بررسی قرار خواهیم داد.

عوامل موثر در بروز آلودگی مایکوپلاسمایی

منابع مختلفی می‌توانند در آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول دخیل باشند.

به عنوان مثال پرسنل آزمایشگاه منابع اصلی آلودگی ناشی از گونه‌های M. orale، M. fermentans و M. hominis هستند. این گونه‌های مایکوپلاسما بیش از نیمی از عفونت‌های مایکوپلاسما را در کشت‌های سلولی تشکیل می‌دهند و از نظر فیزیولوژیکی در دستگاه اوروفارنکس انسان یافت می‌شوند.

سرم جنین گاوی نیز یکی از اجزای مهم کشت سلولی به شمار می‌رود. اما می‌تواند منبع دو گونه مایکوپلاسمایی  M. arginini و A. laidlawii باشد.

محلول خنثی‌کننده تریپسین نیز که به منظور توقف عملکرد تریپسین بعد از جداکردن سلول‌ها از کف ظروف کشت استفاده می‌شود، از پانکراس خوک تهیه می‌گردد. این محلول می‌تواند یکی از منابع اصلی آلودگی توسط M. hyorhinisباشد.

۱. محیط، سرم یا معرف های آلوده به مایکوپلاسما

مایکوپلاسماها می‌توانند به غشاهای فیلتر مورد استفاده در استریل کردن محیط‌های کشت سلولی، سرم‌ها و سایر معرف‌ها نفوذ کنند. زیرا به دلیل عدم وجود دیواره سلولی و ابعاد کوچکی که دارند، بسیار انعطاف‌پذیر هستند.

در دهه‌های ۱۹۶۰ و ۱۹۷۰، محصولات سرم، منبع اصلی آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول بودند. اما امروزه سرم‌ها و محیط‌کشت‌های خریداری شده از تولیدکنندگان معتبر به‌ندرت منبع آلودگی مایکوپلاسما هستند. با این وجود نباید این موضوع را نادیده گرفت.

برای حذف مایکوپلاسما از سرم و محلول‌ها، روش فیلترینگ نقش مهمی دارد. در اکثر آزمایشگاه‌های کشت سلولی از غشاهای فیلتری با اندازه منافذ ۰/۲ میکرومتر برای فیلتر کردن محیط‌ها یا محلول‌های دیگر استفاده می‌شود. اما این فیلتر ممکن است برای محلول‌هایی که غلظت آلودگی مایکوپلاسما در آن‌ها بالاست، مناسب نباشد. در شرایط مشکوک باید از فیلترهایی با اندازه منافذ ۰/۱ میکرومتر به جای فیلترهای ۰/۲ میکرومتر استفاده شود.

۲. لوازم غیر استریل

استریلیزاسیون نامناسب لوازم، یکی دیگر از علل دخیل در بروز آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول است. بسته‌بندی بیش از حد تجهیزات حین اتوکلاو کردن، باعث گرم شدن ناهمگن و استریل نشدن تمام قسمت‌های یک ابزار کشت سلولی می‌شود. چرخه استریلیزاسیون خیلی کوتاه نیز اشتباه دیگری است که منجر به استریلیزاسیون نادرست می شوند. پس توصیه می‌شود حین استریل کردن تجهیزات کشت سلولی، اندازه، جرم، ماهیت و حجم مواد، در نظر گرفته شود.

نگهداری لوازم و محلول‌های استریل شده محیط عاری از گرد و غبار و حشرات  نیز یک الزام برای جلوگیری از آلودگی مجدد است.

۳. پرسنل آزمایشگاه

پرسنل آزمایشگاه نیز یکی از عوامل اصلی آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول در نظر گرفته می‌شوند. به عنوان مثال، M. orale، گونه‌ای از مایکوپلاسما است که معمولاً در دهان و حلق انسان یافت می‌شود. این گونه یکی از علل آلودگی بسیاری از کشت‌های سلولی است.

صحبت کردن، عطسه، عدم پوشیدن لباس مخصوص و سهل انگاری در پوشیدن کت و دستکش آزمایشگاهی تمیز از دلایل اصلی انتشار ذرات در طول پردازش معمول کشت سلولی است.

۴. انکوباتور، منبع آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول

انکوباتورها نیز یکی دیگر از دلایل آلودگی کشت سلولی هستند. باز و بسته کردن مکرر درب این تجهیزات حین کشت، می تواند ذرات آلوده را در محیط پخش کرده و سبب آلودگی تجهیزات یا محیط کشت‌های دیگر شود.

رعایت “روش‌های خوب آزمایشگاهی” برای جلوگیری از انتشار مایکوپلاسما در ضروری است.

۵. نیتروژن مایع

شاید برایتان عجیب به نظر برسد، اما نیتروژن مایع نیز می‌تواند یکی از منابع مایکوپلاسما باشد. مایکوپلاسماها می‌توانند در نیتروژن مایع زنده بمانند. اگرچه ممکن است تکثیر نشوند، اما همین زنده ماندن، می‌تواند کشت‌های سلولی ذخیره شده در نیتروژن مایع را آلوده کنند. بنابراین، توصیه می‌شود که ظروف کشت، در فاز بخار مخازن نیتروژن مایع نگهداری شوند.

۶. آئروسل‌ها

آئروسل‌ها را می‌توان یکی از علل بزرگ و اساسی در بروز انواع عفونت و آلودگی محسوب کرد. آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلولی نیز از این قاعده مستثنی نیست.

هوای یک اتاق یا آزمایشگاه در صورتی که هیچ فعالیتی انجام نشود و دستگاه تهویه نیز روشن نباشد، تقریباً عاری از آلاینده‌های بیولوژیکی است. اما، به محض ورود افراد به اتاق، ذراتی که ته نشین شده‌اند به راحتی دوباره معلق شده و سبب آلودگی می‌شوند.

۷. استفاده بیش از حد از آنتی بیوتیک‌ها

استفاده از آنتی بیوتیک‌ها در کشت سلولی برای جلوگیری از آلودگی میکروبی در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی رایج است. اما پیامد استفاده بیش از حد از آنتی بیوتیک‌ها، مقاومت آنتی بیوتیکی است. به همین دلیل بیشتر محققین معتقد هستند که کشت سلولی را بدون آنتی بیوتیک انجام دهند.

۸. پوشش نامناسب ظروف کشت

یکی دیگر از راه‌های ورود آلودگی مایکوپلاسمایی در کشت سلول، درپوش نامناسب ظروف کشت است. مسیر آلودگی میکروبی زمانی فراهم می‌شود که دیواره‌های جانبی ظروف و درپوش آن‌ها خیس شده و میکروب‌ها از طریق سطح مرطوب به کشت منتقل شوند.

پیامدهای آلودگی مایکوپلاسمایی در کشت سلول

رشد بیش از حد مایکوپلاسما می‌تواند منجر به از دست دادن کشت سلولی شود. لازم به ذکر است که رفتار مایکوپلاسماها در کشت سلولی‌ مختلف، متفاوت است. به عنوان مثال مایکوپلاسما می‌تواند از تکثیر سلولی جلوگیری کند. افزایش مرگ سلولی، شکستگی کروموزوم و تغییرات عددی کروموزوم از دیگر اثرات گونه‌های مختلف مایکوپلاسما بر کشت سلولی هستند.

همچنین اگزونوکلئاز و اندونوکلئاز تولید شده توسط مایکوپلاسماها در تجزیه DNA و RNA سلول‌های یوکاریوتی موثر هستند.

روش‌های پیشگیری از آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول

همانطور که گفته شد، آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول دلایل مختلفی دارد. به همین دلیل روش جلوگیری از بروز آن نیز بسته به علت، متفاوت خواهد بود. در ادامه راهکارهایی را برای جلوگیری از آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول بیان خواهیم کرد.

۱. بهبود تکنیک‌ها

بهبود تکنیک‎های کشت سلولی، به‌کارگیری تکنیک‌های آسپتیک و نظارت دقیق بر پرسنل توسط یک اپراتور ماهر می‌تواند به کاهش خطر آلودگی مایکوپلاسما کمک کند.

۲.  آزمایش کشت‌ها ازنظر آلودگی

از آنجایی که یکی از منابع اصلی آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول، محیط‌های خریداری شده است، پیشنهاد می‌شود سلول‌ها را از بانک‌های سلولی قابل اعتماد تامین کنید.

در مورد آلودگی مایکوپلاسمایی در سلول‌هایی که واقعاً ارزشمند و نادر هستند، روش‌های از بین بردن عفونت پیشنهاد می‌شود. در غیر این صورت توصیه می‌شود سلول‌های آلوده به مایکوپلاسما را دور بیندازید زیرا منبع آلودگی در آزمایشگاه محسوب می‌شوند. در صورت استفاده از کشت‌های مشکوک به آلودگی، توصیه می‌شود، لوازم، انکوباتور، هود و محیط را کاملا ضدعفونی کنید.

۳. محدود کردن استفاده از آنتی‌بیوتیک

 در حالت ایده‌آل، آنتی بیوتیک‌هایی که برای کشت سلولی استفاده می‌شوند باید همه آلاینده‌ها را از بین ببرند، برای سلول‌های میزبان غیرسمی باشند و در آزمایش‌ها تداخلی ایجاد نکنند.

اما در واقعیت، هیچ یک از آنتی بیوتیک‌های موجود، معیارهای ذکر شده را ندارند. بنابراین لازم است کاربرد آنتی بیوتیک‌ها در کشت سلولی محدود شود. در عوض، رعایت تکنیک آسپتیک نقش مهمی در پیشگیری از آلودگی دارد.

۴. قرنطینه کردن سلول‌های جدید

  همانطور که در بخش‌های قبلی توضیح داده شد، سلول‌های جدید که از آزمایشگاه‌های دیگر آورده شده‌اند، باید یکی از منابع آلودگی شناخته می‌شوند. بنابراین، لازم است سلول‌ها را قرنطینه کرده و آن‌ها را از نظر آلودگی مایکوپلاسما بررسی کنید.

۵. انجام بررسی‌‌های روتین

از بین بردن مایکوپلاسما بسیار دشوار است. بنابراین، ساده‌ترین راه برای جلوگیری از آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول، بررسی دوره‌ای کشت‌ها است. با بررسی روتین کشت‌ها می‌توان نمونه‌‌های آلوده را مشخص کرد و با حذف آن‌ها، از آلوده شدن سایر رده‌های سلولی جلوگیری نمود.

روش‌های شناسایی آلودگی مایکوپلاسمایی در کشت سلول

 روش کشت میکروبیولوژیکی یکی از بهترین روش‌ها و همچنین روش تایید شده رسمی برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلولی است. در این آزمایش یک نمونه از مایع رویی کشت سلولی مشکوک، به محیط کشت مناسب برای مایکوپلاسما اضافه می‌شود. نمونه در شرایط هوازی در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت دو هفته انکوبه می‌شود. نمونه‌های مثبت روی پلیت‌های آگار کلنی‌های کوچکی شبیه تخم‌مرغ‌های سرخ‌شده با قطر ۱۰۰-۴۰۰ میکرومتر نشان خواهند داد.

لازم به ذکر است که برخی از سویه‌های مایکوپلاسما نمی‌توانند به خوبی کشت شوند.

دومین روش تایید شده برای بررسی آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول، رنگ آمیزی DNA است. اگرچه عملاً یک آزمون آسان و سریع است، اما گاهی اوقات تفسیر نتایج دشوار است. اگر شرایط کشت سلولی خوب نباشد، نتایج رنگ آمیزی DNA اشتباه تفسیر می‌شود. به همین دلیل داشتن مهارت و تجربه در رنگ‌آمیزی اهمیت بالایی دارد.

آلودگی مایکوپلاسما را می‌توان به کمک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) نیز تشخیص داد. PCR آسان، حساس، سریع، قابل اعتماد، کارآمد و مقرون به صرفه است.

روش‌های جدیدی مانند هیبریداسیون فلورسانس در محل (FISH) یا سنجش‌های مبتنی بر تشخیص تولید آدنوزین تری فسفات (ATP) نیز برای بررسی آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول وجود دارند. اما حساسیت این آزمایشات هنوز کاملا تایید نشده است. با این‌وجود، سرعت این سنجش‌ها بسیار بالا است. به عنوان مثال، نتایج آزمایش FISH را می‌توان طی ۲ تا ۳ ساعت منتشر کرد.

حذف آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلولی

 همانطور که در بخش‌های قبلی گفته شد، حذف مایکوپلاسما از کشت‌های آلوده بسیار دشوار و در برخی مواقع کاملا غیرممکن است. اما محققین ممکن است از یکسری روش‌ها به منظور از بین بردن آلودگی مایکوپلاسما استفاده کنند. به عنوان مثال:

• روش‌های فیزیکی مانند اتوکلاو
• روش‌های شیمیایی مانند مواد شوینده
• روش‌های ایمونولوژیک مانند آنتی سرم‌های اختصاصی مایکوپلاسما
• استفاده از آنتی‌بیوتیک

لازم به ذکر است که تاکنون هیچ روش مؤثر و سازگاری برای ریشه‌کنی مایکوپلاسما ابداع نشده است و هریک از روش‌های مذکور، تاثیر نسبی دارند.

ماکرولیدها (Macrolides)، تتراسایکلین‌ها (tetracyclines) و کینولون‌ها (quinolones) سه گروه از آنتی بیوتیک‌های بسیار فعال در برابر مایکوپلاسماها هستند.

آنتی بیوتیک های مختلف با اثرات بازدارنده متفاوت بر متابولیسم سلولی می‌توانند برای از بین بردن آلودگی مایکوپلاسما مفید باشند. با این وجود به دلیل مقاومت آنتی‌بیوتیکی، ممکن است استفاده از آنتی‌بیوتیک برای از بین بردن آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول، چندان مفید نباشد.

اتوکلاو کردن کشت‌های سلولی آلوده بهترین راه برای خلاص شدن از شر عفونت‌ها است. البته در مورد سلول‌های ارزشمند آلوده به مایکوپلاسما، اتوکلاو نمی‌تواند مفید باشد. زیرا ممکن است به ساختار سلول‌ آسیب برساند.

برای از بین بردن مایکوپلاسما از سرم جنین گاوی و تریپسین، تابش اشعه ماوراء بنفش موثرتر از روش‌های ذکر شده است. اشعه ماوراء بنفش به اجزای سرم آسیب نمی‌رساند.

لازم به ذکر است که برای تأیید ریشه‌کنی کامل مایکوپلاسما، بررسی مکرر کشت ضروری است. توصیه می‌شود پس از حداقل چهار تا شش پاساژ زیر کشت، سلول‌ها را در محیط عاری از آنتی بیوتیک بررسی کنید.

سخن پایانی

آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول یکی از معضلات بزرگ آزمایشگاه‌ها است. منابع اصلی آلودگی مایکوپلاسما از پرسنل گرفته تا مواد و تجهیزات مورد استفاده در کشت سلولی متفاوت هستند. 

برای جلوگیری از آلودگی مایکوپلاسمایی کشت سلول، توصیه می‌شود از یک روش خوب آسپتیک استفاده شود، آزمایشگاه تمیز نگه داشته شود و کشت‌های مثبت دور ریخته شوند.

در این مطلب سعی کردیم به بررسی آلودگی مایکوپلاسما در کشت سلول، علل و راه‌های جلوگیری از آن بپردازیم.

اما علاوه بر ماکوپلاسما، عوامل دیگری نیز می‌توانند سبب آلودگی کشت سلولی شوند. برای آگاهی از این عوامل نی‌توانید به مقاله “چگونه از آلودگی کشت‌ سلول جلوگیری کنیم؟ ” مراجعه کنید.