آزمایش‌ها و آزمایشگاهقارچ‌شناسی

اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی (بخش ششم)

ترجمه و تنظیم: دکتر محمد قهری

۹/۱/۱/۴- گونه‌های کلورلا و پروتوتکا (Chlorella and Prototheca species)

گونه‌های کلورلا و پروتوتکا جلبک‌هایی هستند که سلول‌های قارچی و شبه مخمری تولید می‌کنند و می‌توان آن‌ها را در نمونه‌های کلینیکی یافت. این سلول‌ها جوانه نمی‌زنند. اندازه‌ی سلولی و خواص افتراق دهندگی آن‌ها در جدول شماره ۱ نشان داده شده است. هر دو جنس را می‌توان با سفید کالکوفلور (CFW) رنگ آمیزی کرد اما در رنگ آمیزی‌های هیستوشیمیایی بهتر و واضح‌تر دیده می‌شوند.

اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی – آزمایش مستقیم و کشت (بخش اول)
بخوانید
سلول‌های کلورلا
سلول‌های کلورلا

جدول شماره ۱: جلبک‌هایی که سلول‌های شبه مخمری تولید می‌کنند.

نام ارگانیسم اندازه (میکرومتر) مرفولوژی متحدالشکل یا متنوع تولید سودوهایفی یا هایفی حقیقی اشکال اختصاصی/ ملاحظات
گونه‌های کلورلا

۱۴-۵

متغیر غایب سلول‌های شبه مخمری

تولیدمثل غیرجنسی از طریق ایجاد ۴ تا ۱۰ اسپور که بعد از بالغ شدن رها می‌شوند.

معمولا در حضور نور رنگ سبز تولید می‌کند.

پروتوتکا ویکرهامی ۱۱-۲ متغیر غایب سلول‌های شبه مخمری

تولیدمثل غیرجنسی از طریق ایجاد ۴ تا ۱۰ اسپور که بعد از بالغ شدن رها می‌شوند.

پروتوتکا زوپفی ۲۵-۸ متغیر غایب درمقاطع هیستولوژیکال که رنگ‌های هیستوشیمی بکار برده شده است معمولا بهتر دیده می‌شوند.
اسپورهای پروتوتکا ویکرهامی
اسپورهای پروتوتکا زوپفی
اسپورهای پروتوتکا زوپفی – رنگ آمیزی GMS

A: تصویر پروتوتکا در مقطع بافتی
B,C,D: تصاویر کلنی‌های کوچک سفید مشابه بترتیب از چپ به راست: استافیلوکوک، مخمر، پروتوتکا
E: تصویر پروتوتکا  زوپفی در لام مرطوب بزرگنمایی ۴۰۰ برابر
F: کلنی‌های پروتوتکا زوپفی در محیط کشت prototheca isolation media

اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی – آزمایش مستقیم و کشت (بخش دوم)
بخوانید

۹/۱/۱/۵- میکروسپوریدی‌ها (Microsporidia)

میکروسپوریدی‌ها پاتوژن‌های تک سلولی و داخل سلولی هستند که تا همین اواخر به عنوان پارازیت در نظر گرفته می‌شدند. آنالیز فیلوژنتیک مشحص کرد که این ارگانیسم‌ها با سلسله‌ی قارچ‌ها ارتباط نزدیک داشته و به آن تعلق دارند. میکروسپوریدی‌ها یک گروه هتروژن از ارگانیسم‌هایی هستند که شامل تعدادی جنس و تعداد زیادی گونه می‌باشند. این ارگانیسم‌ها در حیوانات مختلف بیماری‌های مختلفی را ایجاد می‌کنند. در انسان‌ها بیماری‌های مربوط به این ارگانیسم‌ها در طول فاز اولیه‌ی اپیدمی HIV شناخته شدند که عفونت‌هایی (غالبا) در مجاری گوارشی و سیستم اعصاب مرکزی ایجاد می‌کرد. عفونت‌های قرنیه نیز ممکن است هم در افراد دارای سیستم دفاعی سالم و هم آسیب دیده ایجاد شوند. نوع نمونه‌ای که برای آشکار کردن میکروسپوریدی‌ها تهیه می‎‌شود به فرآیند بیماری بستگی دارد. این نمونه‌ها شامل نمونه‌ی مدفوع برای آنتریت، تراشه‌های قرنیه یا بیوپسی برای بیماری‌های چشم و بیوپسی بافت برای لزیون‌های عمقی می‌باشند. رنگ آمیزی‌های مناسب برای میکروسپوریدیاها اغلب رنگ آمیزی‌های بر پایه‌ی کروموتروپ (مانند تریکروم) و یا روشن کننده‌های اپتیکال فلئورسنتی (نظیر سفید کالکوفلور) هستند. رنگ آمیزی‌های میکروسپوریدیاها با توجه به طبیعت کوچک ارگانیسم (۱ تا ۲ میکرون) نیاز به بزرگنمایی قوی میکروسکپی، مواد کنترلی و پرسنل بسیار مجرب و ماهر دارد.

اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی – آزمایش مستقیم و کشت (بخش سوم)
بخوانید
رنگ آمیزی تریکروم اصلاح شده (وبر گرین) اسپورهای میکروسپوریدیا: A: اسپورهای رنگ شده در نمونه مدفوع B: همان نمونه با بزرگنمائی قوی تر
رنگ آمیزی تریکروم اصلاح شده (Ryan-Blue) اسپورهای میکروسپوریدیا: A: اسپورهای رنگ شده در نمونه مدفوع B: میکروسپوریدیوم در بافت روده
رنگ آمیزی تریکروم اسید فست از اواوسیست ایزوسپورا بلی (اسید فست اصلاح شده مثبت) و اسپورهای میکروسپوریدیا (رنگ تریکروم اصلاح شده)

۹/۱/۲- شناسایی و افتراق کپک‌ها در آزمایش مستقیم

اولین مرحله در شناخت مشخصات کپک‌ها در نمونه‌های کلینیکی این است که تعیین شود که آیا فقط هایفی وجود دارد یا مخلوطی از هایفی و مخمر یا سودوهایفی دیده می‌شود؟ سودوهایفی به‌وسیله‌ی دراز شدن جوانه‌ها تشکیل می‌شود. در مقابل هایفی حقیقی از سلول‌های مخمری تولید شده و از یک لوله‌ی زایا منشاء می‌گیرد یعنی اصل و منشاء آن یک لوله‌ی زایا است. سودوهایفی در نقاط اتصال سلولی فشرده می‌شود و اغلب شبیه به زنجیره‌های سوسیس دیده می‌شوند. این برعکس هایفی حقیقی است که در آن معمولا هیچگونه فشردگی دیده نمی‌شود. در سودوهایفی، در نقاطی که فشردگی دیده می‌شود بلاستوکونیدی زایی و انشعاب سودوهایفال اتفاق می‌افتد در حالیکه در هایفی حقیقی انشعاب از طریق سلول‌های ویژه‌ای صورت می‌گیرد.

اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی – آزمایش مستقیم و کشت (بخش چهارم)
بخوانید

در جدول شماره ۲ معیارهای افتراق سودوهایفی و هایفی حقیقی نشان داده شده است. اگر مخمر و هایفی یا سودوهایفی دیده شود آنگاه احتمالا یکی از قارچ هایی که در بخش ۹/۱/۱ شرح داده شد حضور دارند.

جدول شماره۲: معیارهای افتراق بین هایفی حقیقی و هایفی کاذب (سودوهایفی)

هایفی حقیقی سودوهایفی
رشد از ناحیه راسی هایفا بوسیله‌ی دراز شدن خطی و ایجاد دیواره‌های عرضی بعدی حاصل می‌شود. رشد در نتیجه‌ی یک پروسه‌ی بادکردن و ایجاد فشردگی متعاقب آن در هر بلاستوکونیدی جدید که از سلول مادری ایجاد می‌شود رخ می‌دهد.
سلول انتهایی هایفی معمولا درازتر از سلول قبلی بلافاصله قبل از دیواره‌ی عرضی است. سلول انتهایی یک سودوهایفی نوعا کوتاه‌تر یا هم اندازه‌ی سلول قبلی آن است.
سلول انتهایی معمولا سیلندری شکل است. سلول انتهایی معمولا گرد شده است.
دیواره‌های سلولی نوعا موازی هستند و هیچگونه فرورفتگی در محل دیواره عرضی (سپتوم) دیده نمی‌شود. دیواره‌ها نوعا حاوی فشردگی هایی در محل سپتوم‌ها هستند.
سپتوم‌ها  منظم و صاف هستند و منکسر کننده‌ی نور می‌باشند. تمیز دادن و تشخیص دادن سپتوم‌ها مشکل است و معمولا منحنی شکل و خمیده هستند.
انشعابات جانبی در نقاط منشاء خودشان فشردگی ندارند و اولین سپتوم از هایفی اصلی کمی فاصله دارد. انشعابات جانبی در نقاط اتصال به منشاء خود دارای فشردگی هستند و یک سپتوم در محل انشعاب وجود دارد.

در مرحله‌ی بعد نوع هایفی که حضور دارد باید درنظر گرفته شود. هایفی‌ها یا سنوسیتیک هستند (به عنوان مثال هایفی هایی که دیواره‌ی عرضی کمی دارند : کپک‌های موکوراسئوس) و یا سپتوم دارند. بعد از آن پیگمانتاسیون هایفی‌ها و سپس جزئیات مرفولوژیک دیگر باید در نظر گرفته شوند. همچنین حضور فرم‌های اختصاصی که ممکن است مطابق با نوع قارچ عامل عفونت وجود داشته باشند. هایفی‌های سنوسیتیک هایفی‌های کپک‌های موکوراسئوس و Pythium insidiosum (یک ارگانیسم شبه قارچی – از دسته‌ی اواومیست‌ها) هستند. این‌ها اغلب به شکل نوار (ribbon-like) در آزمایش مستقیم و مقاطع هیستولوژیکی مشاهده می‌شوند. این منظره بدین علت ظاهر می‌شود که دیواره‌های هایفی اغلب موازی هم نیستند و بدلیل فقدان دیواره‌های عرضی منظم روی یکدیگر تا می‌شوند. فقدان سپتوم‌ها و تمایل به انشعاب در زوایای مستقیم نیز هایفی این ارگانیسم‌های رشته‌ای را مشخص می‌کند.

هایفی کاذب مربوط به کاندیدا آلبیکنس
کلنی پیتیوم اینسیدیوزوم بعد از 5 روز کشت در دمای 37 درجه بر روی محیط سابورو و منظره میکروسکپی آن که دارای هایفی های با سپتوم های اندک می باشد.

اگرچه هایفی‌ها کاملا aseptate نیستند، قطعات کوتاه هایفی که در آزمایش مستقیم دیده می‌شوند ممکن است فاقد سپتوم باشند. این اشکال معمولا برای تعیین مشخصات هایفی در نمونه‌ی بیمار کفایت می‌کنند. به ندرت در نواحی آناتومیک حفره‌دار مانند سینوس‌های هوایی اطراف بینی ساختمان‌های اسپورزایی مثل اسپورانژیوم یا حتی خیلی به ندرت زیگوسپورها ممکن است دیده شوند. هایفی‌های سپتوم‌دار معمولا به آسانی از هایفی‌های سنوسیتیک تمیز داده می‌شوند اما گاهی اوقات هایفی‌های متورم شده‌ی مربوط به یک کپک سپتوم‌دار و شفاف موجب اشتباه می‌شوند.

هایفی‌های سنوسیتیک مربوط به جنس رایزوپوس

هایفی‌ها یا شفاف و یا فئوئید (دیماتیاسئوس) هستند. هایفی‌های شفاف می‌توانند سپتوم‌دار و یا سنوسیتیک باشند درحالیکه همه‌ی هایفی‌های فئوئید مربوط به کپک‌های دارای سپتوم می‌باشند. اگرچه هایفی‌های سپتوم‌دار شفاف و با انشعاب دوشاخه (زاویه‌ی حاد) اغلب به عنوان آسپرجیلوس (consistent with Aspergillus) در نظر گرفته می‌شوند، اکثر کپک‌های شفاف هایفی‌هایی تولید می‌کنند که از یکدیگر غیرقابل تشخیص هستند. بطور مشابهی حضور هایفی‌های پیگمانته (کمرنگ تا پررنگ) صرفا حضور دیماتیاسئوس‌ها را تائید می‌کند. بدون کشت یا بدون حضور یک ساختمان اختصاصی مثل کونیدی، طبیعت دقیق قارچ عامل عفونت را نمی‌توان شناخت. هایفی‌های مونیلیفرم که واجد تورم سلولی هستند گاهی دیده می‌شوند و ممکن است با هایفی‌های سنوسیتیک اشتباه شوند. اگرچه حتی با سلول‌های متورم یک کپک شفاف سپتوم‌دار قطر هایفی ممکن است بوسیله‌ی پهنای سپتوم تعیین شود. به‌علاوه تعداد سپتوم‌ها معمولا در هایفی‌های دارای دیواره‌ی عرضی (septate) بیشتر از هایفی‌های سنوسیتیک است.

اصول و روش‌های نشان دادن قارچ‌ها در نمونه‌های کلینیکی – آزمایش مستقیم و کشت (بخش پنجم)
بخوانید
هایفی ملانیزه مربوط به قارچ دیماتیاسئوس

ساختمان‌های اختصاصی که نوعا در کشت دیده می‌شوند گاهی اوقات در بافت‌های عفونی شده تشکیل می شوند. این ساختمان‌ها ممکن است کلید شناسایی قطعی عامل عفونی باشند و یا اینکه امکان شناسایی آن را فراهم کنند. همانند کپک‌های موکوراسئوس این ساختمان‌های اختصاصی عموما هنگامی که قارچ در یک حفره یا در یک فضای هوادار مستقیما با هوا مواجه می‌شود تشکیل می‌گردند. مثال‌ها شامل حضور آسپرجیلوم (سر کونیدیال یا میوه‌آور) گونه‌های آسپرجیلوس، کونیدیاهای گلابی شکل کمپلکس گونه‌های سودوآلشریا بویدی‌ایی یا کونیدیاهای موریفرم آلترناریا در مخاط سینوس‌های بینی بیماری با توپ قارچی است.

برخی از کونیدی‌ها که به‌طور نرمال در میسلیوم تولید می‌شوند ممکن است در بافت‌های عفونی نیز ایجاد شوند. مثالی برای این مورد تولید نادر آلوروکونیدی (aleuroconidia) در بافت‌های بیماری است که با آسپرجیلوس ترئوس عفونی شده است. در مقابل پیتیوم اینسیدیوزوم (P. insidiosum) هایفی‌های سنوسیتیک و اغلب بدون اسپورولاسیون در کشت و نیز in vivo  حتی در حضور حفره‌ها تولید می‌کند. سایر کپک‌های فیالیدیک مانند فوزاریوم، آکرومونیوم، Phialemonium، و پسیلومایسس ممکن است فیالیدها و کونیدی‌هایی در بافت‌های عفونی شده (شامل عروق خونی) تولید کنند. اگرچه افتراق کپک‌ها به‌وسیله‌ی مرفولوژی به تنهایی ممکن است نسبت به افتراق مخمرها و قارچ‌های شبه مخمری کمتر تمیز دهنده باشد اما همچنان اطلاعات مفیدی ارائه می‌دهند -که می‌تواند تا زمانی که عامل شناسایی شود – راهنمای درمان آنتی میکروبیال باشد. به‌عنوان مثال تائید اینکه عناصر هایفال سنوسیتیک هستند (یعنی به یکی از اعضای کپک‌های موکوراسئوس یا پیتیوم تعلق دارند) می‌تواند برای کلینیسین اطلاعات مفیدی به منظور راهنمای درمان ضدمیکروبی تجربی فراهم کند.

M54A- Principles and Procedures for Detection  of Fungi in Clinical Specimens—Direct  Examination and Culture; Approved Guideline. October 2012

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا